劉曉娟，謝雙雙，張 晶，康燕華

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北張家口 075002

盡管新的診斷技術(shù)和治療方法不斷被應(yīng)用于臨床，但是宮頸癌患者的預(yù)后仍然不令人滿意。研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是引起宮頸癌患預(yù)后不佳的主要因素，p38MAPK由MAPK14基因編碼，是引起宮頸癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移的重要蛋白[1]，但是其具體的調(diào)控機(jī)制尚不完全明確。最新研究證實(shí)了微小RNA(miRNA)與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，miRNA可通過直接靶向靶基因的信使RNA(mRNA)誘導(dǎo)其講解或轉(zhuǎn)錄抑制，從而轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)從而參與腫瘤的發(fā)展[2]。miR-3928是近年來新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)的miRNA，有研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-3928的水平可以促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展，提示miR-3928具有抑癌作用[3]，但是miR-3928在宮頸癌中的作用尚不清楚。此外，miRNA的靶向作用又被長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)的靶向調(diào)控，LncRNA會(huì)像“海綿”一樣吸附miRNA從而調(diào)控靶基因的表達(dá)[4]。最新研究發(fā)現(xiàn)TTN-AS1可通過靶向miR-4677-3p促進(jìn)ZEB1基因的表達(dá)，從而發(fā)揮促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲[5]。本研究主要分析RNA TTN-AS1通過miR-3928 調(diào)節(jié)p38MAPK參與宮頸癌進(jìn)展的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人宮頸癌細(xì)胞系CasKi(ATCC公司，美國(guó))。DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司，美國(guó))。miR-3928類似物(mimic)、TTN-AS1和p38MAPK過表達(dá)質(zhì)粒及相應(yīng)的陰性對(duì)照(NC)(Thermo Fisher公司，美國(guó))。Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國(guó))。雙熒光素酶報(bào)告試劑盒和相應(yīng)的熒光檢測(cè)儀(Promega公司，美國(guó))。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)試劑盒(Beyotime生物技術(shù)研究所，中國(guó))。凋亡檢測(cè)試劑盒和FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀(BD Biosciencesg公司，美國(guó))。Transwell小室和基質(zhì)凝膠(BD Biosciences公司，美國(guó))。PCR引物由Genewiz公司(中國(guó))設(shè)計(jì)和合成。Trizol試劑(Invitrogen公司，美國(guó))。逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR試劑盒(Roche公司，瑞士)。ABI 7500 PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Life technology公司，美國(guó))。 放射免疫沉淀法(RIPA)裂解緩沖液(Beyotime公司，中國(guó))。二喹啉甲酸(BCA)蛋白測(cè)定試劑盒和電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(北京Applygen公司，中國(guó))。p38MAPK、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體和二抗(Abcam公司，美國(guó))。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad公司，美國(guó))。

1.2生物信息學(xué)分析 通過工具網(wǎng)站GEPIA分析腫瘤基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)的宮頸癌患者TTN-AS1水平與宮頸癌進(jìn)展情況和與MAPK14水平之間的關(guān)系。預(yù)測(cè)TTN-AS1靶向miR-3928和miR-3928靶向p38MAPK的結(jié)合位點(diǎn)。

1.3雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞分為對(duì)照組和miR-3928模擬組(mimic組)，并分別通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NC和miR-3928mimic。在驗(yàn)證miR-3928靶向p38MAPK時(shí)，分別將野生型的p38MAPK(p38MAPK-wt)或突變的p38MAPK(p38MAPK-mut)克隆到pMIR-REPORT熒光素酶載體中。然后分別通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)或蛋白質(zhì)免疫印跡法(Westernblot)檢測(cè)各組miR-3928和p38MAPK的水平。

在驗(yàn)證TTN-AS1時(shí)靶向miR-3928時(shí)，分別將TTN-AS1-wt和TTN-AS1-mut克隆到pMIR-REPORT熒光素酶載體中。將CasKi細(xì)胞接種在6孔板中，然后使用Lipofectamine 2000將克隆和突變的序列轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。使用熒光素酶報(bào)告檢測(cè)儀評(píng)估熒光素酶活性。

1.4qPCR檢測(cè)TTN-AS1、miR-3928和p38MAPK mRNA 通過Trizol獲得細(xì)胞中總RNA，然后驗(yàn)總RNA的純度和濃度。使用cDNA試劑盒將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(42 ℃下60 min，70 ℃下5 min，然后4 ℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)(在95 ℃ 10 min，40個(gè)循環(huán)，94 ℃ 15 s，60 ℃/1 min，60 ℃ 1 min，4 ℃保存)。GAPDH作為mRNA和LncRNA的內(nèi)參，U6作為miRNA的內(nèi)參，通過比較循環(huán)閾值(ΔΔCt)用于分析RNA的表達(dá)。

1.5Westernblot檢測(cè)p38MAPK蛋白的表達(dá) 在液氮下將細(xì)胞研磨，在液氮保護(hù)下使用RIPA裂解緩沖液裂解，并使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)量總蛋白含量。然后使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的總蛋白(120 V下電泳90 min)，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(50 V,120 min)，在含有5%脫脂牛奶的封閉溶液中封閉。然后將PVDF膜與一抗(1∶1 000稀釋)在4 ℃孵育過夜，然后加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑盒可視化蛋白條帶，并使用ImagePD軟件使用GAPDH作為內(nèi)參對(duì)蛋白條帶的灰度進(jìn)行定量。

1.6細(xì)胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染 將CasKi細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃。5% CO2，相對(duì)濕度100%。將細(xì)胞分為4組，即對(duì)照組、mimic組、mimic+TTN-AS1組和TTN-AS1組。使用Lipofectamine 2000試劑盒進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，其中mimic組和mimic+TTN-AS1組通過轉(zhuǎn)染miR-3928 mimic質(zhì)粒以過表達(dá)miR-3928，mimic+TTN-AS1組和TTN-AS1組轉(zhuǎn)染p38MAPK質(zhì)粒過表達(dá)p38MAPK。對(duì)照組轉(zhuǎn)染兩種NC質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.7CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 將細(xì)胞接種于96孔板(每孔2×104個(gè)細(xì)胞，100 μL)，在培養(yǎng)第48 h加入10 μL CCK-8試劑并在37 ℃下培養(yǎng)，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度計(jì)算相對(duì)細(xì)胞活力。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將細(xì)胞消化后重懸，在2×105個(gè)細(xì)胞中分別加入異硫氰酸熒光素(FITC) Annexin V和7-氨基放線菌素D(7-AAD)各10 μL和5 μL，然后分別室溫、避光下分別孵育15 min，然后通過進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)，通過配套Cell Quest軟件分析凋亡率。

1.9荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn) 在Transwell小室的上室加入基質(zhì)膠，底室加入完全培養(yǎng)基，然后將2×104個(gè)細(xì)胞加入至上室培養(yǎng)48 h。48 h后洗去未侵入底室的細(xì)胞。然后將細(xì)胞使用20%甲醇固定，并用0.2%結(jié)晶紫染色。在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)視野侵入底部室的細(xì)胞數(shù)目。

2 結(jié) 果

2.1生物信息學(xué)分析結(jié)果 在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，根據(jù)GEPIA的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)高水平的TTN-AS1的宮頸癌患者具有更短的無進(jìn)展生存期(P<0.05)，并且TTN-AS1的水平與MAPK14的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)(r=0.320,P<0.05)。見圖1。

注：A為GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中TTN-AS1表達(dá)與宮頸癌患者無進(jìn)展生存期的相關(guān)性;B為GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中TTN-AS1表達(dá)與MAPK14表達(dá)的相關(guān)性；TPM為每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的Transcripts；HR為生存資料的效應(yīng)量，比較一段時(shí)間內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)。

2.2TTN-AS1直接靶向miR-3928 TTN-AS1靶向miR-3928的結(jié)合位點(diǎn)見圖2。然后通過雙熒光霉素試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了同時(shí)轉(zhuǎn)染NC+TTN-AS1-wt和NC+TTN-AS1-mut的細(xì)胞的熒光酶素活性分別為(1.00±0.09)、(1.04±0.12)，與miR-3928 mimic+TTN-AS1-mut比較(0.98±0.16)，miR-3928 mimic+TTN-AS1-wt細(xì)胞的熒光酶素活性顯著降低(0.34±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明TTN-AS1直接靶向miR-3928。

2.3miR-3928靶向抑制p38MAPK的表達(dá) miR-3928靶向p38MAPK的結(jié)合位點(diǎn):MAPK14(位置6589-6595)的堿基序列5′……agccaacuggggagaGAGCUUCu……3′與miR-3928的堿基序列3′-cguccgccuuggaauCUCGAAG-5′具有結(jié)合位點(diǎn)。然后通過雙熒光霉素實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了同時(shí)轉(zhuǎn)染NC+p38MAPK-wt和NC+p38MAPK-mut的細(xì)胞的熒光酶素活性分別為(1.00±0.07)、(1.02±0.15)，與miR-3928 mimic+p38MAPK-mut比較(0.95±0.12)，miR-3928 mimic+p38MAPK-wt細(xì)胞的熒光酶素活性顯著降低(0.350±0.045)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步研究也發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組[分別為(3.36±0.31)、(2.83±0.34)]比較，轉(zhuǎn)染miR-3928mimic后，細(xì)胞中p38MAPKmRNA和蛋白的水平降低[分別為(0.83±0.08)、(1.27±0.14)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 TTN-AS1直接靶向miR-3928的結(jié)合位點(diǎn)

2.4各組細(xì)胞中TTN-AS1、miR-3928、p38MAPK mRNA和蛋白的水平 mimic組miR-3928水平高于對(duì)照組，TTN-AS1、p38MAPK mRNA和蛋白水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TTN-AS1組miR-3928水平低于對(duì)照組，TTN-AS1、p38MAPK mRNA和蛋白水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。mimic+TTN-AS1組miR-3928水平低于mimic組，TTN-AS1、p38MAPK mRNA和蛋白水平高于mimic組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-3928對(duì)p38MAPK的抑制作用被TTN-AS1阻斷，見表1。

表1 各組細(xì)胞中TTN-AS1、miR-3928、p38MAPK mRNA和蛋白的水平比較

2.5各組細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡情況比較 mimic組的細(xì)胞活力顯著低于對(duì)照組，凋亡率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TTN-AS1組的細(xì)胞活力高于對(duì)照組，細(xì)胞凋亡率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且mimic+TTN-AS1組的細(xì)胞活力高于mimic組，細(xì)胞凋亡率低于mimic組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。過表達(dá)TTN-AS1會(huì)阻斷miR-3928對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用和對(duì)凋亡的促進(jìn)作用，見表2、圖3。

表2 各組細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞活力和凋亡率比較

2.6各組細(xì)胞侵襲能力比較 mimic組的細(xì)胞侵襲能力[(20.37±2.08)個(gè)]低于對(duì)照組[(37.67±3.57)個(gè)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TTN-AS1組的細(xì)胞侵襲能力[(57.86±3.98)個(gè)]高于對(duì)照組[(37.67±3.57)個(gè)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且mimic+TTN-AS1組的細(xì)胞侵襲能力[(39.40±3.14)個(gè)]高于mimic組[(20.37±2.08)個(gè)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。過表達(dá)TTN-AS1會(huì)部分逆轉(zhuǎn)miR-3928對(duì)細(xì)胞侵襲的抑制作用，見圖4。

注：A為對(duì)照組、B為mimic組、C為mimic+TTN-AS1組、D為TTN-AS1組。

注：A為對(duì)照組、B為mimic組、C為mimic+TTN-AS1組、D為TTN-AS1組。

3 討 論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)最近的統(tǒng)計(jì)報(bào)告，2018年宮頸癌新病例數(shù)為569 847例，占所有腫瘤的3.2%。并且2018年死于宮頸癌的患者共有311 365例，占所有惡性腫瘤的3.3%[6]。雖然許多早期診斷宮頸癌的新生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，并且靶向藥物、免疫療法等新的治療手段被不斷地應(yīng)由于宮頸癌的治療，但由于腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和獲得性耐藥的發(fā)生，仍有一部分患者不能取得較好的預(yù)后[7]。探究宮頸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提高是發(fā)展新的診斷和治療策略的基礎(chǔ)。

抑癌基因和促癌基因的異常低表達(dá)和過表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的主要機(jī)制，p38MAPK蛋白最初在炎癥和應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，后來被認(rèn)為是一種與腫瘤相關(guān)的蛋白[8]。在宮頸癌中，p38MAPK發(fā)揮促癌作用，激活p38MAPK相關(guān)通路會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲，是宮頸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制之一[9]。并且p38MAPK蛋白的表達(dá)會(huì)受到miRNA的靶向調(diào)節(jié)，miR-374b可通過抑制p38MAPK抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡[10]。HE等[11]研究結(jié)果顯示人類早期內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖能力的升高伴隨著miR-3928水平的降低，提示miR-3928具有抑制細(xì)胞增殖的作用。XIA等[12]發(fā)現(xiàn)肺組織中miR-3928的表達(dá)水平與肺鱗狀細(xì)胞癌患者的惡性表型和不良預(yù)后有關(guān)。并且miR-3928 可具有直接靶向抑制Dicer 蛋白表達(dá)的作用[13]。本研究預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了miR-3928可直接靶向抑制p38MAPK的表達(dá)。

miRNA靶向mRNA的過程受到LncRNA的靶向調(diào)控。LncRNA是一類長(zhǎng)鏈RNA，其長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸，不具有蛋白質(zhì)翻譯功能。LncRNA可以通過競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA的方式作為“海綿”“吸附”miRNA，從而調(diào)節(jié)miRNA在mRNA降解和翻譯中的作用[14]。LncRNA通過靶向miRNA調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)也是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制之一。本研究結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)高水平的TTN-AS1的宮頸癌患者具有更短的無進(jìn)展生存期，并且TTN-AS1的水平與MAPK14的轉(zhuǎn)錄水平正相關(guān)。并且也進(jìn)一步驗(yàn)證了TTN-AS1與miR-3928之間存在靶向關(guān)系。TTN-AS1在多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用，包括口腔鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌及前列腺癌等[15-17]。本研究結(jié)果顯示過表達(dá)TTN-AS1會(huì)顯著抑制miR-3928的水平，促進(jìn)p38MAPK的表達(dá)，并阻斷miR-3928對(duì)p38MAPK的抑制作用。過表達(dá)miR-3928明顯降低了細(xì)胞活力和細(xì)胞侵襲能力。而TTN-AS1能夠上調(diào)細(xì)胞活力和細(xì)胞侵襲能力，抑制細(xì)胞凋亡。過表達(dá)TTN-AS1會(huì)顯著阻斷miR-3928對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲的抑制作用和對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。FU等[18]研究顯示TTN-AS1可通過靶向抑制 miR-134-5p促進(jìn)MBTD1的表達(dá)并抑制骨肉瘤細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)耐藥。JIA等[19]發(fā)現(xiàn)TTN-AS1可通過靶向miR-142-5p/CDK5促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示在宮頸癌中，TTN-AS1通過靶向miR-3928促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲，抑制凋亡。

綜上所述，miR-3928靶向抑制p38MAPK的表達(dá)，TTN-AS1可通過直接靶向miR-3928上調(diào)p38MAPK的水平。TTN-AS1通過靶向調(diào)控miR-3928/p38MAPK促進(jìn)CasKi細(xì)胞的增殖和侵襲并抑制凋亡。關(guān)于TTN-AS1和miR-3928在宮頸癌患者中的臨床意義值得進(jìn)一步研究，關(guān)于TTN-AS1和miR-3928通過p38MAPK調(diào)節(jié)宮頸癌進(jìn)展的作用尚待進(jìn)一步的體內(nèi)研究。