王甩艷，張秀明，林喜榮，羅燕萍，賀玉瑩，莫紅梅△

1.深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，廣東深圳 518001；2.深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)醫(yī)學(xué)檢驗中心，廣東深圳 518001

精液常規(guī)檢測是對男性生育能力進(jìn)行評估的基礎(chǔ)檢查項目，但對精子功能的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)不能做出評估[1-2]。精子 DNA 檢測包括精子 DNA 碎片指數(shù)(DFI)和精子高DNA著色性(HDS)。精子DFI是一個被認(rèn)為較各種常規(guī)精液參數(shù)更為有效的男性不育指標(biāo)，可以預(yù)測自然受孕和體外受精的結(jié)果[3-5]。精子HDS指高可染性的精子即核未完全縮合的不成熟精子占總精子的百分?jǐn)?shù)，反映的是精子的成熟度[6]。精子DNA損傷有關(guān)的因素包括年齡、環(huán)境污染物等[7]。本文對男性不育患者的精子DFI、HDS與其形態(tài)和患者年齡進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在探討其在男性生殖能力評估上的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年5月至2020年1月深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院生殖中心的601例患者精液樣本。601例患者婚后均正常性生活1年以上不育，無外傷及遺傳性疾病家族史，體檢未發(fā)現(xiàn)明顯睪丸、附睪及輸精管異常等，且基本排除女方不孕因素。正常形態(tài)精子百分比為0.00%～9.00%，平均(3.45±1.91)%；年齡21～72歲，平均(35.76±7.43)歲。

1.2精子形態(tài)學(xué)分析 采用改良巴氏染色，按照世界衛(wèi)生組織(WHO)《人類精液檢查與處理實驗室手冊第5版》標(biāo)準(zhǔn)[8]，進(jìn)行精子形態(tài)評價，正常形態(tài)精子百分比參考范圍≥4.00%。

1.3精子DFI和HDS檢測方法 使用的儀器是流式細(xì)胞儀(mindray,BriCyte E6)，采用FCSAS軟件分析精子的DFI和HDS。檢驗原理是正常精子DNA緊密結(jié)合而具有抗酸性，維持雙鏈的穩(wěn)定性，而受損的或不成熟的精子形成松散的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，其DNA在酸作用下變成單鏈，吖啶橙(AO)與雙鏈 DNA結(jié)合發(fā)出綠色熒光，與單鏈 DNA 結(jié)合發(fā)出紅色熒光，然后通過配有專用軟件的流式細(xì)胞儀得出相關(guān)參數(shù)。DFI≤15%：精子DNA完整性好；15%15%：精子成熟染色質(zhì)含量異常。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以[n(%)]表示，組間差異采用非參數(shù)檢驗分析，受檢者的正常形態(tài)精子及患者年齡與精子 DFI和HDS 的相關(guān)性均采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1精液樣本檢測結(jié)果 受檢的601例精液樣本中，精子DNA完整性好的有243例(40.43%)；精子DNA完整性一般的有241例(40.10%)；精子DNA完整性差的有117例(19.47%)。精子成熟染色質(zhì)含量正常的有494例(82.20%)，精子成熟染色質(zhì)含量異常有107例(17.80%)。

2.2正常形態(tài)精子百分比與精子DFI和HDS的相關(guān)性 依據(jù)正常形態(tài)精子百分比將患者分為<4.00%組和≥4.00%組，分析兩組精子不同程度DNA完整性和成熟染色質(zhì)含量的分布情況，見表1、2。隨著正常形態(tài)精子百分比的增大，精子DFI≤15%的個體所占的比率逐漸上升，而精子DFI≥30%和15%

表1 兩組DFI比較

表2 兩組HDS比較

2.3年齡與精子DFI和HDS的相關(guān)性 依據(jù)年齡將患者分為<35歲、35～<40歲和≥40歲3組，分析3組之間的精子不同程度DNA完整性和成熟染色質(zhì)含量的分布情況，見表3、4。隨著年齡的增大，精子DFI≤15%的個體所占的比率逐漸下降，而精子DFI≥30%和15%0.05)。Pearson相關(guān)分析表明患者年齡與精子DFI呈正相關(guān)(r=0.132,P<0.05)，患者年齡與精子HDS無相關(guān)(r=0.020,P>0.05)。

表3 各組DFI比較

表4 各組HDS比較

3 討 論

精子DNA損傷是男性不育的主要分子原因，這對生育有負(fù)面影響。依據(jù)WHO指南，精液分析檢測常規(guī)參數(shù)是評估男性生育能力的主要方法。然而，常規(guī)的精液分析對男性生育能力的預(yù)測是很有限的，很多時候并不能夠解釋男性不育的原因。在全球范圍內(nèi)進(jìn)行精子DNA片段分析，可作為男性不育癥的預(yù)后和診斷及其管理的工具[9]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，精子在受孕和胚胎發(fā)育過程中也扮演了重要角色，包括遺傳物質(zhì)表達(dá)異常、表觀遺傳規(guī)律紊亂、DNA完整性降低等。因此在評估男性生育力時，精子DNA完整性受到越來越多的關(guān)注。

精子DNA是父源遺傳物質(zhì)，其完整性對子代健康的重要性不言而喻。精子DNA損傷影響DNA堿基對的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，直接導(dǎo)致了遺傳信息的缺失并影響生物轉(zhuǎn)化功能，從而阻礙胚胎形成[10]。李清琴等[11]研究表明精子DFI與精子活力呈負(fù)相關(guān)，且升高水平與精子活力的下降程度有關(guān)，提示精子DNA損傷可能存在與精子活力下降相同的影響機(jī)制。前者研究的是DFI與精液常規(guī)參數(shù)相關(guān)分析，而本文在其基礎(chǔ)上，旨在研究的是DFI和HDS與受檢者的正常形態(tài)精子百分比及年齡的關(guān)系，DFI反映的是精子DNA完整性好或差，是作為檢測精子DNA損傷的一個重要指標(biāo)，而HDS反映精子成熟染色質(zhì)含量正常與否，是對精子DNA損傷的重要補充依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，正常形態(tài)精子百分比≥4.00%與<4.00%這兩組間的DFI和HDS差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。精子DFI和HDS與正常形態(tài)精子百分比呈負(fù)相關(guān)，表明精子碎片率高且其成熟染色質(zhì)含量異?？赡軙?dǎo)致精子形態(tài)的異常，或者精子形態(tài)缺陷可伴有DNA碎片的增加和成熟染色質(zhì)含量異常。而精子畸形會導(dǎo)致受精能力降低。

本研究各年齡組之間的DFI比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且年齡與精子DFI呈正相關(guān)，即年齡越大，DFI越高，精子DNA的完整性越差。但是患者年齡與精子HDS無相關(guān),說明年齡可能對于精子染色質(zhì)的成熟影響不大。CROSNOEL等[12]研究表明隨著父方年齡的增大，單基因突變會每年增加兩個，這對精子與受精卵的成功結(jié)合及胚胎的正常發(fā)育有著重要的作用。同時也有相關(guān)研究表明年齡增長，男性生育力下降，精液參數(shù)變差包括精子活動力、精子活率等降低[13]。因此，年齡增長導(dǎo)致精子DNA損傷概率增大和精子形態(tài)異常率升高。

精子DNA的損傷水平能顯著性的預(yù)測宮頸內(nèi)授精、宮腔內(nèi)授精和體外授精等助孕手段的成功率，而且精子DNA損傷與卵細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射及體外授精助孕治療后的妊娠風(fēng)險增加顯著相關(guān)[14-15]。

精子DFI、HDS與精子形態(tài)均呈負(fù)相關(guān)，精子DFI與患者年齡呈正相關(guān)，故年齡是影響精子DNA完整性的因素之一，并且精子DNA損傷會導(dǎo)致精子形態(tài)的異常，因此精子DFI和HDS應(yīng)與常規(guī)精液參數(shù)等綜合分析，這在男性的不育原因診斷、精子生殖能力評估和人工輔助生殖結(jié)局的預(yù)測上有著非常重要的作用，同時需清楚精子DNA損傷的內(nèi)在機(jī)制，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。