吳宙光,王 斌,程 珍,張文杰,鄭佳辰,李一帆

深圳市兒童醫(yī)院普外二區(qū)，廣東深圳 518026

先天性膽管擴(kuò)張癥(CBD)是一種良性的先天性膽道異常，以肝外和/或肝內(nèi)膽管的囊性擴(kuò)張為特征，該病通常發(fā)生在兒童時(shí)期，CBD常與胰膽交界處相關(guān)，并可與復(fù)發(fā)性膽管炎、肝硬化、膽總管結(jié)石、胰腺炎、膽管癌等長期并發(fā)癥相關(guān)，表現(xiàn)為腹痛、嘔吐和黃疸，大多數(shù)輕微兒童膽管炎患者可以保守治療，而一些患有嚴(yán)重膽管炎的兒童需要膽汁引流，炎癥得到控制后，行擴(kuò)張膽管切除和肝管空腸吻合術(shù)[1-2]。但術(shù)前或術(shù)后常引起各類并發(fā)癥導(dǎo)致病情遷移，而尋找有效的治療靶點(diǎn)對疾病的診斷及治療十分重要。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)屬于轉(zhuǎn)化生長因子家族的組成部分，主要介導(dǎo)細(xì)胞的生長、增殖和損傷修復(fù)[2]。白細(xì)胞介素-32(IL-32)主要由病原體和促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)，在免疫細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，IL-32作為細(xì)胞因子是細(xì)胞信號(hào)通路的重要組成部分，參與細(xì)胞生長、代謝、激素信號(hào)、免疫等多種生理功能的調(diào)節(jié)。早期研究表明IL-32調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、代謝和免疫，參與肝膽等免疫炎癥性疾病的病理調(diào)節(jié)或作為保護(hù)劑[3-5]。本研究擬通過探討CBD患兒中IL-32和TGF-β1的表達(dá)水平及其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性研究，為進(jìn)一步早期識(shí)別和治療該類疾病提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年12月至2019年12月本院兒科住院收治的CBD患兒72例為研究組，其中男42例、女30例，年齡為9個(gè)月至14歲，平均(7.2±3.6)歲，另選取同期肝移植供體肝膽管組織正常的40例患者作為對照組，男26例、女14例，年齡為8個(gè)月至13歲，平均(7.0±3.8)歲，兩組年齡、性別、體質(zhì)量、手術(shù)時(shí)間、出血量等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有研究組均行手術(shù)根治性治療，其中有2例急性梗阻性化膿性膽囊炎患兒進(jìn)行膽總管造瘺術(shù)引流后再行手術(shù)治療。兩組研究對象知情并簽署知情同意書。

1.2TGF-β1、IL-32水平及病理組織檢測 所有研究對象采集空腹靜脈血液5～10 mL，1 000 r/min室溫下離心后取上清液，-80 ℃保存。獲取研究組的肝組織和膽管組織標(biāo)本，4%多聚甲醛固定后，于4 ℃保存，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法對所有研究對象的血清TGF-β1、IL-32水平進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行操作(武漢默沙克生物科技有限公司)。使用熒光定量PCR法檢測肝組織TGF-β1、IL-32的mRNA相對表達(dá)水平，用Trizol法提取肝組織中RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)配合相應(yīng)體系在CFX96Touch熒光定量PCR儀上機(jī)反應(yīng)(美國伯樂公司)，TGF-β1、IL-32的mRNA相對表達(dá)水平檢測是基于基因表達(dá)閾值(Ct)的方法，即mRNA(2-ΔΔCt)進(jìn)行計(jì)算，樣本間重復(fù)3次。將患兒膽管組織標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)病理檢測[2]，根據(jù)不同病理程度(HE染色)可分為黏膜上皮細(xì)胞脫落(中度、重度)、肉芽組織增生(中度、重度)、管壁增生肥厚(中度、重度)、炎癥細(xì)胞浸潤(中等、大量)。免疫組化檢測包括石蠟切片、脫蠟、封閉、修復(fù)抗原，采用相應(yīng)的TGF-β1、IL-32抗體(上海賽默飛Invitrogen公司)進(jìn)行檢測，計(jì)算相應(yīng)陽性細(xì)胞百分比。測定結(jié)果判讀：在高倍鏡下采用病理圖像分析系統(tǒng)對免疫組化結(jié)果進(jìn)行判定，膽囊壁、膽管壁切片中出現(xiàn)棕褐色或棕黃物為相應(yīng)的TGF-β1及IL-32抗體陽性，不顯色則為陰性。

1.3觀察指標(biāo) 兩組研究對象的血清TGF-β1、IL-32水平及其肝組織中mRNA相對表達(dá)水平進(jìn)行比較，分析CBD患兒肝功能指標(biāo)[丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、血清總膽汁酸(TBA)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GGT)]與血清TGF-β1、IL-32的相關(guān)性,以及CBD患者膽管不同病理程度的TGF-β1和IL-32表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清TGF-β1和IL-32水平及其肝組織中mRNA相對表達(dá)水平比較 研究組血清TGF-β1和IL-32水平較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。熒光定量PCR顯示，研究組肝組織中TGF-β1和IL-32 的mRNA相對表達(dá)水平較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2CBD患兒肝功能指標(biāo)與血清TGF-β1、IL-32的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，CBD患兒的血清TGF-β1、IL-32與ALT、AST及γ-GGT水平呈正相關(guān)(P<0.05)。見表2。

表1 兩組血清TGF-β1和IL-32水平比較

圖1 兩組肝組織中TGF-β1和IL-32 的mRNA相對表達(dá)水平比較

表2 CBD患兒肝功能指標(biāo)與血清TGF-β1、IL-32的相關(guān)性

2.3CBD患者膽管不同病理程度的TGF-β1和IL-32的表達(dá)情況 CBD患者膽管不同病理程度的TGF-β1、IL-32表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 CBD患者膽管不同病理程度的TGF-β1和IL-32表達(dá)情況[n(%)]

3 討 論

CBD是兒童高發(fā)性的膽道畸形疾病，目前發(fā)病率逐年上升，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，主要機(jī)制是膽管與胰管在十二指腸壁外合流的先天性畸形的解剖學(xué)因素，由于十二指腸乳頭括約肌無法控制住合流部引起膽汁與胰液的逆流，導(dǎo)致膽道及胰腺相關(guān)性病理改變[6-8]。主要臨床癥狀包括腹部上區(qū)包塊、腹痛和黃疸，常合并膽囊炎、膽結(jié)石、膽道狹窄等癥狀，通常采用手術(shù)治療，但存在多種并發(fā)癥可能，甚至癌變[2,7]。因此，尋找潛在血清學(xué)生物標(biāo)志物，對于疾病的診斷和防治十分重要。

TGF-β1是具有多種生物功能的細(xì)胞因子，在細(xì)胞的增殖、分化、瘢痕形成及免疫調(diào)節(jié)等方面至關(guān)重要，機(jī)體出現(xiàn)損傷后，TGF-β1在肌成纖維細(xì)胞中表達(dá)升高，而TGF-β1水平的升高又能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，利于組織的損傷修復(fù)[9]。TGF-β1可誘導(dǎo)其他生長因子的生長促進(jìn)膠原蛋白的合成，刺激纖維素生成，增強(qiáng)細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用，同時(shí)能夠減少細(xì)胞間基質(zhì)蛋白的合成，下調(diào)金屬蛋白酶的活性，促進(jìn)組織生理修復(fù)，觸發(fā)對組織的纖維化修復(fù)作用[10]。TGF-β1也可通過抑制過度的炎癥，調(diào)節(jié)免疫炎癥本身是組織修復(fù)的一個(gè)重要決定因素[11]。另外，TGF-β1還是誘導(dǎo)肝纖維化最重要的細(xì)胞因子，該細(xì)胞因子可通過TGF-β1/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路直接激活肝衛(wèi)星細(xì)胞，導(dǎo)致肝纖維化形成[12]。研究表明，TGF-β1在膽汁淤積性肝硬化、肝內(nèi)膽管結(jié)石合并膽管狹窄患者中表達(dá)升高主要促進(jìn)其向膽管細(xì)胞增殖分化[9,13]。本研究提示TGF-β1在CBD的表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)膽道的纖維化增生[2]。近期病理組織免疫組化研究表明TGF-β1在CBD的膽管壁明顯高于膽囊壁，說明膽管壁的損傷在CBD患者中更為敏感[2]，但本研究尚未進(jìn)行相關(guān)的亞組分析，今后需擴(kuò)大樣本和分組分析進(jìn)一步證實(shí)。本研究還發(fā)現(xiàn)，研究組肝組織中TGF-β1和IL-32 的mRNA相對表達(dá)水平較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CBD患者膽管不同病理程度的TGF-β1、IL-32表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明TGF-β1和IL-32水平參與了CBD疾病的發(fā)生發(fā)展，可通過促進(jìn)膽道細(xì)胞增殖分化、促進(jìn)組織的修復(fù)，調(diào)節(jié)炎癥免疫功能，有利于病情程度的判定和監(jiān)測。

IL-32是一種新型的細(xì)胞因子，參與炎癥和癌癥的發(fā)生，其基因主要由8個(gè)小外顯子組成，IL-32最初是通過有絲分裂原和激活的自然殺傷細(xì)胞在激活的T細(xì)胞中選擇性表達(dá)的，在各種人體組織和器官中廣泛表達(dá)，如肺、肝臟、肌肉、腎臟、胰腺和大腦[3]。既往研究表明，IL-32在多種炎癥性疾病患者中上調(diào)，是一種主要的促炎因子，由炎性反應(yīng)誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)[3,5,14-15]。本研究中CBD患兒IL-32與病情嚴(yán)重度明顯相關(guān)，考慮CBD患兒中主要是大量炎性因子的釋放導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，觸發(fā)一系列的生物學(xué)反應(yīng)，促進(jìn)肝纖維化發(fā)生，出現(xiàn)膽道狹窄，從而引起膽道的膽管擴(kuò)張。

本研究中CBD患兒的TGF-β1、IL-32水平與肝功能指標(biāo)(ALT、AST及γ-GGT)呈正相關(guān)，與以往研究結(jié)果較為一致[5]。其中TGF-β1可加重炎性反應(yīng)和繼發(fā)組織的纖維化[9]。IL-32水平升高與肝炎活動(dòng)明顯相關(guān)，主要是通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB 信號(hào)通路或加強(qiáng)協(xié)同刺激分子B7-H6與自然殺傷細(xì)胞表面受體NKP30相互作用，可促進(jìn)IL-32的表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡[4]。肝功能指標(biāo)(ALT、AST)在肝細(xì)胞受損時(shí)能夠釋放入血，是反映肝功能受損的常用指標(biāo)[16]。由于膽管擴(kuò)張易引起炎性反應(yīng)和膽道梗阻性黃疸[4-5]。因此，CBD患兒TGF-β1、IL-32水平與肝功能嚴(yán)重度明顯相關(guān)。

綜上所述，TGF-β1、IL-32水平在CBD患兒中及疾病進(jìn)展起著重要作用，其代表肝損傷的炎癥程度和纖維化水平，為CBD患兒尋求靶向針對TGF-β1、IL-32的新型藥物治療方法的設(shè)計(jì)開辟了新的途徑。