王曉斌，楊宏軍，孫相華，代錫鋒，周華華，白 松△

1.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院干療科，云南昆明 650031；2.云南省曲靖市第一人民醫(yī)院腫瘤科，云南曲靖 655000

結(jié)直腸癌包括結(jié)腸癌和直腸癌，其病理類型有腺癌、鱗癌、腺鱗癌、髓樣癌、印戒細胞癌、未分化癌等，但其中最常見是腺癌。2018年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計報告顯示，全球結(jié)直腸癌的發(fā)病率在所有腫瘤中占第3位[1]。大量研究表明結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展由基因、環(huán)境、遺傳及表觀遺傳學改變等復(fù)雜的因素所致[2]。近年來，隨著基因工程及分子生物學技術(shù)的發(fā)展，腫瘤的靶向治療和免疫治療在結(jié)直腸癌的治療中發(fā)揮了重要作用，因此，尋找新的、有效檢測和治療靶點，闡明結(jié)直腸癌的發(fā)病機制，對結(jié)直腸癌的早期診斷和治療尤為重要。ARD1基因編碼的ARD1蛋白是一個乙酰轉(zhuǎn)移酶，首先是在酵母細胞中發(fā)現(xiàn)的，在酵母細胞中，ARD1蛋白與細胞周期相關(guān)[3]；而在真核細胞中的ARD1蛋白也具有乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，能乙酰化多種蛋白質(zhì)[4]。我國多位學者研究發(fā)現(xiàn)，人ARD1(hARD1)蛋白在胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、鼻咽癌等惡性腫瘤組織中呈高表達[5-8]，但相對于其他很多已知功能的基因和蛋白，ARD1的生物學功能仍不清楚。據(jù)此，本研究通過siRNA特異性抑制人結(jié)直腸腺癌細胞株ARD1的表達，再利用基因芯片技術(shù)分析ARD1沉默前后基因表達譜的變化，旨在通過對其他已知生物學功能的基因變化來闡明ARD1的功能及其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1材料來源 結(jié)直腸腺癌細胞株HCT-8和SW620(中科院上海腫瘤研究所)；培養(yǎng)基Opti-MEM?、LipofectamineTM2000、Trizol(美國Invitrogen公司)； RPMI-1640培養(yǎng)基、L-15粉劑、0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)；焦碳酸二乙酯(DEPC)、二甲基亞砜(DMSO)由美國Sigma公司提供；新生牛血清(中國杭州四季青公司)；PBS干粉(北京中杉金橋公司)；siRNA由RiboBio公司(上海)合成。本研究使用由上海伯豪生物技術(shù)有限公司/生物芯片上海國家工程研究中心提供的安捷倫人全基因4×44K芯片并由該公司提供技術(shù)平臺及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)。

1.2人結(jié)直腸腺癌細胞株HCT-8和SW620培養(yǎng) HCT-8生長于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，SW620細胞生長于含10%新生牛血清的L-15培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2恒溫條件下常規(guī)培養(yǎng)及傳代。

1.3siRNA的設(shè)計合成 本課題組前期的研究中[9]，篩選出沉默效率最高的siRNA，該序列成功將HCT-8和SW620的ARD1基因沉默，并通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)證實該siRNA沉默效率達79.7%(以Actin為內(nèi)參)，其靶序列為GGT GGA GAG CAA AGG CAA T，正義鏈：5′-GGU GGA GAG CAA AGG CAA U dTdT-3′，反義鏈：3′-dTdT CCA CCU CUC GUU UCC GUU A-5′。將該序列交由Ribobio公司合成，陰性對照-siRNA也購自該公司，銳博公司對該序列保密。

1.4siRNA轉(zhuǎn)染HCT-8、SW620細胞 HCT-8和SW620兩株細胞分別設(shè)轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和空白對照組。其中轉(zhuǎn)染組使用ARD1-siRNA按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染步驟進行細胞轉(zhuǎn)染；陰性對照組使用陰性對照-siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟同轉(zhuǎn)染組?？瞻讓φ战M培養(yǎng)板中不做任何處理。

1.5轉(zhuǎn)染效率檢測 轉(zhuǎn)染20 h后，用倒置熒光顯微鏡對各組細胞進行拍照、對比及記錄，觀察結(jié)束后將培養(yǎng)板放入37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6RNA提取和質(zhì)檢 培養(yǎng)72 h后，Trizol試劑提取6個樣品的總RNA，用Nanodrop ND-1000超微量分光光度計檢測RNA濃度和純度，采用安捷倫2100生物分析儀按標準流程評估6個RNA樣品的質(zhì)量，合格樣品的標準是2 100RIN≥7.0并且28S/18S≥0.7。

1.7基因芯片檢測質(zhì)控 各組基因芯片質(zhì)控指標為變異系數(shù)(CV)和檢出率，CV計算方法為標準偏差與平均值之比，用百分數(shù)表示，安捷倫表達譜芯片通過10次重復(fù)探針點信號的CV來判斷芯片的穩(wěn)定性和技術(shù)的穩(wěn)定性；檢出率的計算方法為檢出點總數(shù)與全部探針數(shù)的比值。

1.8芯片的雜交和分析 使用安捷倫微陣列芯片掃描儀對本研究完成雜交的芯片進行掃描，然后用安捷倫特征提取軟件10.7讀取數(shù)據(jù)，用安捷倫基因表達數(shù)據(jù)分析軟件11.0對數(shù)據(jù)歸一化處理，算法為四分位點函數(shù)。差異基因篩選標準為上調(diào)或下調(diào)的倍數(shù)變化(FC)≥2.0或FC≤0.5。為使差異基因更具代表性，本研究分別在兩株細胞的陰性對照組與空白對照組之間比較、轉(zhuǎn)染組與陰性對照組之間比較，比較出兩組細胞的差異基因后用Microsoft office Access 2003軟件求其交集得出共同發(fā)生了變化的基因，再在共同變化的基因中挑選出共同上調(diào)或下調(diào)2倍以上的基因，除去GenBank中沒有注釋的基因后作為研究的基因。將篩選出的表達差異的基因上傳至SBC生物芯片分析系統(tǒng)(網(wǎng)址：http://sas.ebioservice.com/)，采用美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)基本信息注釋(NCBI Entrez Gene 數(shù)據(jù)庫http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)、基因本體論(GO)功能注釋(GO數(shù)據(jù)庫http://www.geneontology.org/)、京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析(KEGG數(shù)據(jù)庫 http://www.genome.jp/kegg/)等方法對差異基因按生物學過程進行歸類，查閱核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(GenBank)及相關(guān)文獻，對其結(jié)果進行深入的分析和討論。

1.9統(tǒng)計學處理 使用SBC生物芯片分析系統(tǒng)(網(wǎng)址：http://sas.ebioservice.com/)，數(shù)據(jù)采用t檢驗進行統(tǒng)計學分析，取P<0.05和q<0.05為篩選顯著性pathway和GO的閾值。

2 結(jié) 果

2.1熒光顯微鏡觀察siRNA轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染20 h后倒置熒光顯微鏡觀察，熒光細胞代表成功轉(zhuǎn)染的細胞，兩株細胞的轉(zhuǎn)染效率均達到80%以上。

2.2各組RNA 樣品的提取和質(zhì)檢結(jié)果 HCT-8-轉(zhuǎn)染組、HCT-8-陰性對照組和HCT-8-空白對照組總RNA樣本的A260/A280的值分別為1.87、1.88、1.90；SW620轉(zhuǎn)染組、SW620-陰性對照組和SW620-空白對照組總RNA樣本的A260/A280的值分別為1.85、1.88、1.89。電泳結(jié)果證實6個樣品均為2 100RIN>7.0并且28S/18S>0.7，說明已抽提到純度較高、完整性較好的總RNA，見圖1、2。

圖1 HCT-8細胞總RNA樣品凝膠電泳圖

圖2 SW620細胞總RNA樣品凝膠電泳圖

2.3基因芯片檢測質(zhì)控 對各組芯片進行檢測質(zhì)控，顯示質(zhì)控指標CV全部小于10%，表示芯片具有良好的穩(wěn)定性和技術(shù)性，見表1。

表1 各組芯片質(zhì)控指標CV和檢出率(%)

2.4差異基因的篩選 安捷倫人全基因表達譜芯片涵蓋了17 704個轉(zhuǎn)錄本(RNA)，通過該芯片分析，HCT-8和SW620兩株細胞陰性對照組與空白對照組比較，共同上調(diào)2倍以上的基因數(shù)有13個，包括IFI44L、XDH、CCL4等，共同下調(diào)2倍以上的基因數(shù)有8個，包括RCOR1、ANKLE1、DUOX1等；轉(zhuǎn)染組與陰性對照組比較，HCT-8和SW620兩株細胞共同上調(diào)2倍以上的基因數(shù)有21個，共同下調(diào)2倍以上的基因數(shù)有15個，見表2、3。

表2 HCT-8和SW620兩株細胞轉(zhuǎn)染組和陰性對照組比較共同上調(diào)2倍以上的基因

表3 HCT-8和SW620兩株細胞轉(zhuǎn)染組和陰性對照組比較共同下調(diào)2倍以上的基因

2.5差異基因的生物學信息分析

2.5.1差異基因功能GO分析 通過GO分析，陰性對照組與空白對照組比較，與分子功能相關(guān)的差異表達基因占0.07%(11/15 374)，其中包括催化活性、運輸活性、結(jié)合、電子載體活性等；與生物過程相關(guān)的差異表達基因占0.09%(13/14 369)，其中包括繁殖、免疫系統(tǒng)過程、代謝過程、細胞過程等功能;與細胞組成相關(guān)的差異表達基因占0.08%(13/16 123)，包括胞外器官、大分子復(fù)合物、突觸等。GO分析結(jié)果顯示，差異表達的基因主要與電子載體活性、病毒繁殖、對刺激的反應(yīng)等相關(guān)性較高。轉(zhuǎn)染組與陰性對照組比較，與分子功能相關(guān)的差異表達基因占0.17%(26/15 374)，其中包括結(jié)構(gòu)分子活動、轉(zhuǎn)運活動、通道調(diào)節(jié)活動、核酸結(jié)合、蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、翻譯調(diào)節(jié)活性、分子傳感器活動及轉(zhuǎn)錄因子活性等；與細胞組成相關(guān)的差異表達基因占0.17%(27/16 123)，包括細胞質(zhì)、細胞外基質(zhì)、細胞膜等。與生物過程相關(guān)的差異表達基因占0.2%(29/14 369)，其中包括:代謝過程免疫系統(tǒng)程序、繁殖程序、發(fā)育過程等；GO分析結(jié)果顯示，差異表達的基因與胞外器官、節(jié)律程序、生殖程序、免疫系統(tǒng)程序、生物黏附、輔助性運輸?shù)鞍谆钚?、翻譯調(diào)控活動、生物過程的正向調(diào)節(jié)等功能相關(guān)性較高。

2.5.2差異基因與信號通路的相關(guān)性分析 差異基因信號通路分析結(jié)果顯示，陰性對照組與空白對照組比較表達差異的基因與自由基誘導(dǎo)細胞凋亡通路、細胞因子與炎性反應(yīng)、IL-17信號通路、細胞因子與細胞因子相互作用、 胰島素信號通路、過氧化物酶體增生物激活受體信號通路等多種重要信號通路相關(guān)。轉(zhuǎn)染組與陰性對照組比較表達差異的基因與Tolls樣受體信號通路、自由基誘導(dǎo)細胞凋亡通路、ERBB2在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤中的作用、細胞因子受體在T細胞極化進程中的選擇性表達、大腸癌、胰腺癌、腎細胞癌、轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路、細胞周期、細胞因子信號通路、促分裂原活化蛋白激酶信號通路、癌癥通路等多種重要信號通路相關(guān)。差異表達的基因中主要是XDH、轉(zhuǎn)化生長因子-β2等基因參與了上述通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

3 討 論

ARD1在健康人體組織中都有表達[10]，但在腫瘤組織，特別是惡性腫瘤組織中呈高表達，本課題組前期的研究中從mRNA和蛋白水平證明了ARD1在人結(jié)直腸腺癌細胞株HCT-8、LS174T和SW620中均為高表達[11]；從蛋白水平證明了ARD1在人體組織中的表達水平結(jié)直腸癌組織高于癌旁和切緣組織，正常結(jié)直腸組織幾乎不表達[6]；在結(jié)直腸癌裸鼠動物模型的腫瘤組織中也得出了類似的結(jié)果[12]。研究發(fā)現(xiàn)ARD1的5種亞型，分別是mARD1198、mARD1225、mARD1235、hARD1131和hARD1235，ARD1在人類正常細胞中，ARD1對細胞增殖起促進作用，但在人類的腫瘤細胞中，起促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用[13-14]。這些研究表明ARD1有可能成為結(jié)直腸癌早期診斷的特異性腫瘤標志物或者基因治療中的特異性靶點。RNA干擾作為未知基因功能的研究手段之一，廣泛應(yīng)用于腫瘤的研究和治療[15-19]；我國學者也預(yù)測RNA干擾藥物可能在未來成為治療腫瘤、艾滋病、阿爾茨海默病等重大疾病的主流藥物[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)ARD1經(jīng)RNA干擾后的轉(zhuǎn)染組和陰性對照組與空白對照組比較，隨著時間的延長，細胞的生長速度顯著減慢，凋亡細胞顯著增多。這不僅證實了ARD1對保持細胞的正?；钚杂兄匾囊饬x和ARD1在細胞生存中的關(guān)鍵作用，同時也反向說明了本研究中siRNA-ARD1對ARD1的沉默效果。此外，利用基因芯片技術(shù)雜交分析后轉(zhuǎn)染組與陰性對照組比較，HCT-8和SW620兩株細胞均出現(xiàn)了ARD1的同源基因ARD1A和ARD1B下調(diào)，再次驗證了本研究中siRNA-ARD1對ARD1的沉默效果。對于siRNA沉默ARD1后出現(xiàn)的這種細胞增殖速度減慢、凋亡增加的現(xiàn)象，推測可能與以下幾種機制有關(guān)：(1)與ARD1的關(guān)系。前面提到ARD1蛋白作為乙酰轉(zhuǎn)移酶，在腫瘤細胞中起促進ARD1作為NATs中增殖和抑制凋亡的作用，當ARD1被siRNA沉默后，靶蛋白被其他乙酰轉(zhuǎn)移酶乙?；?，錯誤的乙?；鞍谉o法被細胞識別而是細胞進入凋亡程序。ARD1與β-catenin有關(guān)。研究證實了在肺癌中ARD1激活了β-catenin，進而激活了cyclin D1促進肺癌發(fā)展的途徑[21]，ARD1對β-catenin乙?；蠹せ钌鲜鐾?，加速癌細胞發(fā)展的細胞周期循環(huán)。有研究發(fā)現(xiàn)ARD1-β-catenin-cyclin D1 途徑中可能有外源性因子直接影響β-catenin或cyclin D1，可能是NATH-hARD1底物乙?；せ盍艘粋€組氨酸轉(zhuǎn)移酶，后者HAT再乙?；?catenin導(dǎo)致它的活化。(2)與轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體的關(guān)系。大量研究證實了脂質(zhì)體作為轉(zhuǎn)染試劑，本身會參與及影響細胞的增殖及凋亡，如抑制ATP酶的活性、參與蛋白激酶C通路調(diào)節(jié)等[22]。而這些作用就是脂質(zhì)體所致的細胞毒性，對細胞的生理活動產(chǎn)生很大的影響。本研究中，對轉(zhuǎn)染后的細胞進行動態(tài)觀察時發(fā)現(xiàn)有時陰性對照組部分細胞出現(xiàn)成片死亡，其原因可能就是該部位由于脂質(zhì)體的濃集導(dǎo)致的細胞成片死亡。因為陰性對照組中加入陰性對照-siRNA不會對細胞基因表達產(chǎn)生影響，通過對比陰性對照組和空白對照組在基因表達譜上的差異，實際上就是驗證脂質(zhì)體對細胞基因表達產(chǎn)生的影響，將對比發(fā)現(xiàn)的差異基因通過信號通路分析，差異基因主要參與了自由基誘導(dǎo)細胞凋亡通路、IL-17信號通路等有關(guān)，其中在自由基誘導(dǎo)細胞凋亡中可能通過上調(diào)XDH基因、介導(dǎo)超氧陰離子發(fā)揮誘導(dǎo)細胞凋亡的作用，從而誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。通過本研究也從基因mRNA層面證明了脂質(zhì)體對細胞生理活動會產(chǎn)生影響。所以，RNA干擾的研究中應(yīng)充分關(guān)注脂質(zhì)體的細胞毒性作用，同時需要研發(fā)新的轉(zhuǎn)染速度快、轉(zhuǎn)染效率和基因沉默率高、細胞毒性低的轉(zhuǎn)染試劑。本研究利用轉(zhuǎn)染組與陰性對照組比較其基因表達譜的差異，是因為轉(zhuǎn)染組和陰性對照組的細胞受到脂質(zhì)體的影響，轉(zhuǎn)染組的siRNA-ARD1進入細胞后可以高選擇性、高效率地沉默ARD1，而陰性對照組中加入的陰性對照-siRNA進入細胞后并不會引起基因表達譜的變化，這樣的設(shè)計最大程度消減了脂質(zhì)體對研究結(jié)果的影響，使實驗結(jié)果更加客觀。此外，本研究將兩株細胞分析所得差異基因的數(shù)據(jù)用Microsoft office Access 2003軟件求其交集得出了共同發(fā)生變化的基因，再在共同變化的基因中挑選出共同上調(diào)和下調(diào)2倍以上的基因，除去GenBank中沒有注釋的基因后作為進一步研究的基因。雖然這樣篩選出的差異基因少了，但這些基因均在兩株細胞中出現(xiàn)了共同的變化，與ARD1和結(jié)直腸癌的關(guān)系更密切，不僅可以減少數(shù)據(jù)分析的工作量，還更有助于發(fā)現(xiàn)與ARD1緊密相關(guān)的基因。按上述方法篩選出基因，經(jīng)GO分析和信號通路分析后，發(fā)現(xiàn)ARD1與結(jié)直腸癌通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路、促分裂原活化蛋白激酶信號通路等相關(guān)性最大，差異表達的基因中主要是轉(zhuǎn)化生長因子-β2基因參與了上述通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)化生長因子-β2是轉(zhuǎn)化生長因子-β家族中的一個亞型，通過檢索Oncomine數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)化生長因子-β2在實體腫瘤中表達水平，在456個研究數(shù)據(jù)中有44個研究表達升高，有34項研究表達降低。趙麗等[23]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β2在肺腺癌組織中表達明顯下調(diào)，且轉(zhuǎn)化生長因子-β2低表達的肺癌患者總生存期更短。在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中，轉(zhuǎn)化生長因子-β也是作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用的[24]。但在細胞分化的各個時期，其機制并不相同，在G1早期，轉(zhuǎn)化生長因子-β通過誘導(dǎo)抑制信號作用于原癌基因c-myc，從而阻止腫瘤形成；而在G1晚期，轉(zhuǎn)化生長因子-β通過增加CDK的抑制性蛋白抑制CDK的功能，使G1期細胞停止生長，進而誘導(dǎo)細胞分化或凋亡。本研究中，結(jié)直腸癌細胞系中ARD1沉默后轉(zhuǎn)化生長因子-β2表達明顯上調(diào)，結(jié)合前期研究，推測ARD1是在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮原癌基因的作用，通過結(jié)直腸癌通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路、促分裂原活化蛋白激酶信號通路等參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究利用基因表達譜芯片分析了siRNA干擾ARD1的表達后對人結(jié)直腸腺癌細胞株基因表達譜的影響，首先，本研究從基因?qū)用孀C明了脂質(zhì)體對細胞的毒性作用，在以脂質(zhì)體為載體的科學實驗中，其對細胞的毒性作用需要研究者引起足夠的重視；另外，本研究初步探討了ARD1的功能和它在人結(jié)直腸腺癌細胞中的生物學效應(yīng)，推測ARD1是在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮原癌基因的作用，通過結(jié)直腸癌通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路、促分裂原活化蛋白激酶信號通路等參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究也為繼續(xù)深入研究ARD1提供了新的線索，為研究者了解結(jié)直腸癌的發(fā)病機制、藥物研發(fā)、疫苗研制和基因治療等更深入的研究提供了理論依據(jù)。