趙明德

(青海民族大學(xué) 生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院,青海 西寧 810007)

胡蘿卜(學(xué)名：DaucuscarotaL.var.sativa Hoffm.)，又稱紅蘿卜或甘荀，為野胡蘿卜(學(xué)名：DaucuscarotaL.var.carota)的變種，本變種與原變種區(qū)別在于根肉質(zhì)、長圓錐形、粗肥、呈紅色或黃色.胡蘿卜每100g鮮重含1.67～12.1mg胡蘿卜素，含量高于番茄的5～7倍，在以胡蘿卜為原料得到的產(chǎn)品中約含有60%的類胡蘿卜素，其中β-胡蘿卜素為89.9%[1].我國北疆胡蘿卜中類胡蘿卜素含量高達(dá)10～45mg/100g[2].另外我國自行培育的93-8胡蘿卜品種β-胡蘿卜素達(dá)15～18mg/100g[3]，均有很高的開發(fā)價值.高等植物如胡蘿卜、番茄、紫(白)蘇、沙棘、火棘、西瓜、玉米等植物中也富含類胡蘿卜素[4-7].類胡蘿卜素還能通過微生物發(fā)酵獲得[5-11].目前，中科院武漢病毒所、江蘇微生物研究所、上海工業(yè)微生物所和上海化工研究院的發(fā)酵法生產(chǎn)β-胡蘿卜素的技術(shù)已經(jīng)成熟，可實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[12].類胡蘿卜素是食品、醫(yī)藥、飼料行業(yè)常用的一類色素，其中β-胡蘿卜素、玉米黃素、辣椒紅、辣椒黃、梔子黃等已被國家批準(zhǔn)為食品添加劑[13-15].目前，大部分企業(yè)使用的β-胡蘿卜素多數(shù)是化學(xué)合成產(chǎn)品[16].但隨著醫(yī)學(xué)毒理學(xué)和生物學(xué)試驗工作的不斷深入，人工合成的色素日益暴露出它的安全隱患，而天然類胡蘿卜素安全性高，有的還具有營養(yǎng)保健價值[17-18]，故對天然類胡蘿卜色素的需求量將日益增加.

類胡蘿卜素具有很強(qiáng)的抗氧化性和消除氧自由基的能力，并且能誘導(dǎo)細(xì)胞間的連接通訊，調(diào)控腫瘤增殖等，具有抗癌、抑癌的作用[19]，同時類胡蘿卜素還可提高動物繁殖能力，是一種生理抗氧化劑，可保護(hù)卵泡和子宮細(xì)胞免受氧化反應(yīng)的破壞，有助于卵巢內(nèi)類固醇的合成，改善子宮內(nèi)環(huán)境，Brief和Chew[20]母豬注射β-胡蘿卜素可使其受胎率提高12.5%，活仔數(shù)增加12.3%.植物角度研究表明，類胡蘿卜素也是植物生存所必不可少的成分，它可以保護(hù)葉綠素免受強(qiáng)光導(dǎo)致的光氧化破壞，同時又是光合天線和反應(yīng)中心不可缺少的結(jié)構(gòu)成分，有些類胡蘿卜素還是ABA合成的前體[21,22].從胡蘿卜中提取類胡蘿素相關(guān)研究很多，主要研究了有機(jī)溶劑提取胡蘿卜中類胡蘿卜素時，有機(jī)溶劑的選擇和最優(yōu)條件，還有超聲波、微波和酶解等作為輔助處理時單個處理條件的最佳工藝條件.還沒有對各種處理方法之間優(yōu)劣比較，處理方法對提取類胡蘿素產(chǎn)生差異的原因等的研究.本文取用青海大通的胡蘿卜為實驗材料，主要采用不同處理方法提取胡蘿卜中的類胡蘿卜素，并對不同的處理方法進(jìn)行優(yōu)缺點相關(guān)性分析，并采用柱層析色譜進(jìn)行分離純化，其工藝投資小，可為胡蘿卜的深加工提供有力參考.

1 材料與方法

1.1 材料

材料：取新鮮黃色胡蘿卜(產(chǎn)地青海大通)洗凈用恒溫鼓風(fēng)干燥箱干燥至恒重，粉碎過40目篩.

試劑：類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品(上海純優(yōu)生物科技有限公司)、丙酮(分析純)、石油醚(分析純)、無水乙醇(分析純)、中性氧化鋁(分析純).

儀器及設(shè)備：722型可見分光光度計(上海)、電子天平FA1604N(上海箐海儀器有限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(102型天津市實驗儀器廠)、SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵(深圳)、手提式組織粉碎機(jī)(上海)、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(上海)、格蘭仕微波爐.

1.2 方法

1.2.1 類胡蘿卜素的提取

取干燥的10g胡蘿卜粉置于250mL錐形瓶中，加入石油醚和無水乙醇混合液，萃取得到的混合液用抽濾瓶抽濾，用石油醚洗滌3次，將所得濾液置于250mL分液漏斗中靜置分層，加入20mL蒸餾水混勻靜置分層，反復(fù)多次至下層無色，得到類胡蘿卜素粗提液.

1.2.2 色譜柱的制備

在柱的最底層放入少量棉花，將石油醚—中性氧化鋁懸浮液加入到10mm*160mm的層析柱中，邊加邊拍打柱體使氧化鋁均勻沉積于柱內(nèi)并保證上表面平整，加到10cm左右時在其上部鋪一張圓形小濾紙，并將色譜柱固定在鐵架臺上.

1.2.3 類胡蘿卜素含量測定方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取一定量的胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品用石油醚稀釋，在波長200～800nm范圍內(nèi)，用TU-1901紫外可見分光光度計進(jìn)行波譜掃描，測定胡蘿卜素的最大吸收波長，作為胡蘿卜素測定波長.結(jié)果顯示，在波長450nm處有最大吸收峰.再精確稱取胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品5mg，用石油醚稀釋定容到50mL容量瓶中，分別準(zhǔn)確移取1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00mL定容至10mL在波長450nm處測定吸光度得表1，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=0.0101X+0.013，相關(guān)系數(shù)為0.999.

圖1 β-胡蘿卜素吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素研究

2.1.1 不同料液比提取效果比較

稱取5份相同質(zhì)量干燥的胡蘿卜粉(10g)，在其他條件相同的情況下，分別用料液比不同(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)的無水乙醇和石油醚混合液(1∶1)進(jìn)行提取，得到的混合液稀釋到500mL，用紫外分光光度計在波長450nm處測定各個吸光度.根據(jù)吸光度值的大小可以求出得率如圖2所示，在料液比1∶10之后類胡蘿卜素的得率變化很小，從降低提取成本考慮，1∶10的料液比是最佳的提取條件.

圖2 料液比對類胡蘿卜素提取的影響

2.1.2 不同浸提時間提取效果比較

稱取5份相同質(zhì)量的胡蘿卜粉(10g)，在其他條件相同的情況下，分別用無水乙醇和石油醚混合液(100mL)進(jìn)行提取，提取時間分別為30min、60min、90min、120min、150min，得到的混合液稀釋到500mL，用紫外分光光度計在波長450nm處測定各個吸光度.根據(jù)吸光度值求出得率如圖3.在90min時達(dá)到最大提取量，90min后由于有機(jī)溶劑的揮發(fā)，時間過長有機(jī)溶劑使類胡蘿卜素降解等因素使得率下降.由此可得90min提取時間是有機(jī)溶劑浸提法最佳的提取時間.

圖3 浸提時間對類胡蘿卜素提取的影響

2.1.3 不同浸提溫度對提取效果的影響

圖4 浸提溫度對類胡蘿卜素提取的影響

稱取5份質(zhì)量相同的干燥胡蘿卜粉(10g)，在其他條件相同的情況下，加入石油醚和乙醇的混合溶液料液比1∶10，在恒溫水浴鍋中分別放置在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃下浸提，提取得到的混合溶液稀釋到500mL，用紫外分光光度計在波長450nm處測各個吸光度.根據(jù)吸光度值求出得率如圖4所示，隨著溫度增高分子運動劇烈，目標(biāo)產(chǎn)物擴(kuò)散速率越大，溶解度增大，提取率增加，在30～40℃下類胡蘿卜的得率最高，當(dāng)溫度高于40℃石油醚揮發(fā)過快同時溫度升高色素降解使得率下降.

2.2 正交試驗結(jié)果及主效應(yīng)分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇提取料液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)進(jìn)行3因素3水平正交試驗(見表2)，固定提取溶劑石油醚與乙醇混合液和原料粉碎細(xì)度(40目)，試驗結(jié)果及數(shù)據(jù)處理結(jié)果如表3所示.

表2 正交因素水平表

由極差分析可知，RC>RB>RA，故影響因素次序為C>B>A，即提取溫度的影響最顯著，其次是提取時間，最后料液比.最佳提取條件組合為A1B3C3，即提取時間120min、提料液比1∶10、取溫度40℃.

表3 正交實驗結(jié)果

2.3 不同輔助條件提取類胡蘿卜素分析

2.3.1 超聲波破碎時間對提取類胡蘿卜素影響

稱取5份質(zhì)量相同的干燥胡蘿卜粉(10g)，在其他條件相同的情況下，加入石油醚和乙醇的混合溶液料液比1∶10，在超聲波下分別處理10min、15min、20min、25min、30min，提取得到的混合溶液稀釋到500mL，用紫外分光光度計在波長450nm處測各個吸光度.根據(jù)吸光度值求出得率如圖5，在超聲處理25min條件下得到最大得率11.13mg/10g，25min之前由于處理還不充分，所以得率較低，25min后由于溫度的變化及溶劑揮發(fā)等因素影響導(dǎo)致得率降低.

圖5 超聲破碎時間對類胡蘿卜素提取的影響

2.3.2 微波破碎時間對類胡蘿卜素提取影響

稱取5份質(zhì)量相同的干燥胡蘿卜粉(10g)，在其他條件相同的情況下，先加入少量蒸餾水使其充分浸濕，然后在微波功率480W分別處理10s、20s、30s、40s、50s，取出加入石油醚和乙醇的混合溶液料液比1∶10，提取得到的混合溶液稀釋到500mL，用紫外分光光度計在波長450nm處測得各個吸光度.根據(jù)吸光度值求出得率如圖6，在30s時類胡蘿卜素得率最高，30s后由于微波破碎升溫較快，溫度超過60℃使類胡蘿卜素分解，同時也因為溫度過高導(dǎo)致微波破碎提取法的類胡蘿卜素得率最低.

圖6 微波破碎時間對類胡蘿卜素提取的影響

3 討論

3.1 不同提取方法分析比較

有機(jī)溶劑法提取胡蘿卜素是當(dāng)前主要的天然類胡蘿卜素提取方法，雖然方法簡單但提取率不高.本試驗考慮采用微波和超聲波作為輔助條件提高類胡蘿卜素的提取率.在微波輔助提取時，類胡蘿卜素的得率為8.71mg/10g，類胡蘿卜素的得率反而將低.由于微波作為提取輔助條件時溫度無法控制，導(dǎo)致處理時間長，溫度過高使類胡蘿卜素分解得率下降；處理時間短，作用不夠充分類胡蘿卜素析出的量少，類胡蘿卜素的得率很低，說明微波提取不利于類胡蘿卜素的提取.超聲波作為輔助條件時類胡蘿卜素得率達(dá)到11.14mg/10g，得率明顯提高，超聲波破碎易于控制溫度，同時細(xì)胞的破碎率較高，利于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)析出，作為輔助條件有利于類胡蘿卜素的提取.

3.2 柱色譜分離中洗脫劑的使用

將提取得到的混合液在恒溫水浴鍋60℃下蒸發(fā)，至體積為5mL左右，加入到制備好的色譜柱中，先用石油醚洗脫得到明黃色洗脫液，再用3∶7丙酮與石油醚混合液洗脫得到橘黃色洗脫液，再用1∶1丙酮與石油醚混合液洗脫得到青黃色洗脫液.經(jīng)本試驗驗證是最理想的洗脫劑使用方法.

4 結(jié)論

有機(jī)溶劑提取法最佳工藝參數(shù)為體積比1∶1石油醚和無水乙醇的混合液作為提取劑，提取時間120min，提取溫度40℃，料液比1∶10，類胡蘿卜素得率為8.98mg/10g.采用微波破碎和超聲波破碎作預(yù)處理時，30℃水浴中超聲破碎最佳時間為25min，得率為11.14mg/10g，微波破碎在功率480W時最佳時間30s，得率為8.71mg/10g.經(jīng)驗證性試驗驗證，超聲波輔助提取時其類胡蘿素得率最高，可以用于實踐.而微波輔助提取時其類胡蘿卜素得率較低，不適合應(yīng)用于胡蘿卜的類胡蘿卜素提取工藝.