楊衛(wèi)民，姬紫薇，鄧 鈺，強 妍，林鏵

（呂梁林果植物化學省市共建山西省重點實驗室培育基地，山西省特色植物功能成分工程研究中心，呂梁學院，山西呂梁 033001）

正北芪又稱恒山黃芪，主要生長在富硒面積達74 km2的北岳恒山山脈。北芪菇為側耳屬平菇，是利用正北芪加工下腳料和多種中草藥及農(nóng)作物副產(chǎn)品作為培養(yǎng)料，經(jīng)科學配方和特殊工藝培育而成的營養(yǎng)豐富、藥用價值較高的新型菌類產(chǎn)品，具有補氣固表、脫毒排膿、保護肝臟、強身健體、滋潤皮膚、催生母乳等功能。

王潤梅等人[1]采用了試管預試法和圓形濾紙層析法對北芪菇化學成分進行的系統(tǒng)研究表明，北芪菇中含有氨基酸、多肽、蛋白質、有機酸、多糖及其苷類、生物堿、黃酮及其苷類、酚性成分、植物甾醇、三萜成分、揮發(fā)油成分等。劉潤平[2]指出北芪菇含有微量元素硒，其含量為0.54 mg/L。硒是谷胱甘肽過氧化酶等的必需組成部分，同時又是體內(nèi)許多蛋白質的組成成分，對動物機體抗氧化、抗應激、提高免疫力等起著重要的作用[3]。植物體中的硒化合物通常具有較高的生理功能及較低的毒性，如硒蛋白和硒代氨基酸[4]。硒蛋白中的硒僅以硒代半胱氨酸（Selenocysteine，SeCys） 和硒代蛋氨酸 （Selenomethionine，SeMet） 2 種形式共價結合在蛋白質中。中科院藥物所分析表明，正北芪含有β - 谷甾醇、亞油酸、亞麻酸、21 種氨基酸、D-B- 天冬素、胡蘿卜甙、二十九烷、膽堿、多糖、微量元素硒等[5]。關于硒近年報道甚多，其防癌抗癌、抗衰老及提高人體免疫功能作用也是公認的。

關于硒的基礎研究中，硒的無機物及有機化合物成為人們研究的熱點，硒化合物含量分析也成為研究的必須手段。無機硒含量分析方法很多，諸如熒光法、X 射線熒光法、分光光度法、氰化物ICP法等[6-9]。但是，對硒代氨基酸的分析一直是研究者的難題之一，原因是同系物的其他氨基酸含量則要比硒代氨基酸含量高幾千倍，造成嚴重干擾。以北芪菇為原料，用稀酸讓蛋白質變性沉淀，酶解法分解蛋白質獲得氨基酸，TLC 法提取制備硒代蛋氨酸，并用質譜儀、紅外光譜儀、熔點儀和旋光儀對其進行表征分析。同時，對北芪菇菌糧和正北芪中硒代蛋氨酸進行了對比分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北芪菇、北芪菇菌糧和正北芪，山西省渾源縣恒山北芪菇專業(yè)合作社提供。

乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、無水乙醇、石油醚、濃硫酸、硝酸、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、乙酸、水合茚三酮，均為分析純；甲醇，分析純和色譜純；硅膠高效G 板；胰蛋白酶，CAS:9002-07-7，國藥集團化學試劑有限公司提供；蛋白酶，CAS:39450-01-6，K FemibionGermany；L - 硒代蛋氨酸，CAS：3211-76-5，Aladddin 提供。

1.2 儀器與設備

DS-T250 型高速多功能粉碎機，上海頂帥工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；THZ-82 型低速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；KQ-100DE 型旋轉蒸發(fā)器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；ALB-224 型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司產(chǎn)品；XH-300B 型微波- 超聲波組合合成/萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；KH-3000Plus 型薄層色譜儀，上海科哲生化科技有限公司產(chǎn)品；Expressions質譜儀和Plate ExpressTLS- 質譜接口，美國Advion公司產(chǎn)品；Tensor-11 型傅里葉紅外光譜儀，德國布魯克公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 硒代氨基酸的提取

（1） 樣品的制備。將北芪菇粉碎，過篩80 目，稱取0.5 g 各3 份置于4 mL 的離心管中，加入質量分數(shù)5%的硝酸溶液3 mL，立即蓋上蓋子劇烈振搖。

以轉速12 000 r/min 離心5 min，去除上清液，用純水洗滌2 次后保留沉淀物質備用。將沉淀物質轉移至250 mL 錐形瓶中，加入Tris-HCl（0.5 mmol/L，pH 值 7.2） 30 mL，超聲處理 5 min。

每隔12 h 依次加入胰蛋白酶（15 mg）、蛋白酶K（15 mg），在 37 ℃下振蕩酶解 （轉速為 100～180 r/min） 共36 h。酶解后，以轉速4 000 r/min 離心10 min。

上清液用截留分子量為3 kD 的超濾離心，除去蛋白酶及大分子物質。用0.45 um 的濾膜抽濾，得到粗提液[10-12]。

（2） 標準品的制備。稱取10 mg 的L- 硒代蛋氨酸于稱量瓶中，加入適量的色譜甲醇溶解，定容至10 mL，得到質量濃度1 mg/mL 的L- 硒代蛋氨酸標準品溶液，置于2～4 ℃冰箱中保存。

1.3.2 薄層層析分離純化

（1） 點樣。活化后用硅膠板冷卻，用毛細管吸取L- 硒代蛋氨酸標準品溶液，在距底邊2 cm 水平線上均勻點上合適的點數(shù)。每次加樣后原點擴散直徑不超過3 mm，干后再點一次[13]。待測品的點樣方法與標準品的點樣方法相同。

（2） 展開。配制正丁醇∶乙酸∶水= 7∶1∶2混合液作為硒代蛋氨酸的展開劑[8]，在展開缸飽和20 min，將已點樣的硅膠板輕輕放入展開缸內(nèi)，待到展開劑前沿距硅膠板頂端約1 cm 處時，取出薄層板晾干，備用。

（3） 薄層色譜成像。將晾干的薄層板放入薄層色譜成像系統(tǒng)，于波長365 nm 處紫外燈下拍照觀察薄層板情況，并拍照記錄。

（4） Rf值計算。觀察已展開的L- 硒代蛋氨酸標準品和待測品薄層板位置一致的斑點，計算Rf值。

1.3.3 質譜儀檢測

（1） 標準品的質譜檢測。用色譜甲醇和超純水作為流動相。將儀器和軟件打開使其處于工作狀態(tài)，用微量進樣器吸取10 μL 的L - 硒代蛋氨酸標準品溶液插入到進樣口處，打到Load 檔開始進樣，進完樣后打回到Inject 檔。點開譜圖界面對譜圖進行分析并保存。

（2） 待測液的質譜檢測。流動相與測標準品的流動相相同。使儀器和軟件處于工作狀態(tài)，將待測品薄層板置于TLC- 質譜接口上，使激光對準圈出的硒代蛋氨酸斑點中心處[14]。用軟件操作進行取樣，點開譜圖界面對譜圖進行分析并保存。

1.3.4 紅外光譜儀檢測

（1） L- 硒代蛋氨酸標準品的檢測。打開儀器，選擇相應的工作界面，擦干凈點樣中心處，測試背景，再用毛細管吸取少量的標準品于點樣中心處，測試樣品，對譜圖界面出現(xiàn)的譜圖進行處理和分析。

（2） 待測品的檢測。將薄層板上畫出的硒代蛋氨酸斑點用小刀取下置于燒杯中，加入10 mL 譜甲醇，過濾。紅外檢測與標準品一致。

1.3.5 紫外含量測定

以甲醇作為參照，設置波長掃描范圍為200～700 nm，對待測樣液進行光譜掃描，得到紫外掃描圖譜，讀出最大吸收峰值。

將L - 硒代氨基酸標準品配置成0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL，檢測并繪制標準曲線。1.3.6 比旋光度和熔點檢測取待測樣液分別進行旋光度、比旋光度的測量。將待測樣液蒸發(fā)結晶，進行熔點的測量。（注：北芪菇菌糧和正北芪也進行了同樣的處理。）

2 結果與分析

2.1 薄層層析成像與分析

L- 硒代蛋氨酸標準品TLC 圖像見圖1，北芪菇樣液顯色前TLC 圖像見圖2，北芪菇樣液顯色后TLC 圖像見圖3。

圖1 L- 硒代蛋氨酸標準品TLC 圖像

圖2 北芪菇樣液顯色前TLC 圖像

圖3 北芪菇樣液顯色后TLC 圖像

經(jīng)過優(yōu)化試驗條件，最終確定所有圖譜的展開劑均為正丁醇∶乙酸∶水（7∶1∶2，V/V）。

圖1 和圖3 是L - 硒代蛋基酸和北芪菇樣液顯色后的圖像，圖2 是北芪菇樣液顯色前的圖像。均用型號為TLC Silica gel 60 F254（5 cm×7.5 cm） 的薄層板展開。

將圖1、圖2 和圖3 進行比對可以發(fā)現(xiàn)，橫線所標注的斑點幾乎處于同一位置。經(jīng)計算圖1 所標注斑點的Rf值為0.368，圖2、3 所標注斑點的Rf值為0.386，由此初步認為圖中所標注的斑點為同一物質，可能均為硒代蛋氨酸。

北芪菇、北芪菇菌糧、正北芪顯色前TLC 圖見圖4，L- 硒代蛋氨酸標準品顯色后TLC 圖見圖5。

圖4 北芪菇、北芪菇菌糧、正北芪顯色前TLC 圖

圖5 L- 硒代蛋氨酸標準品顯色后TLC 圖

圖4 和圖5 均使用了硅膠板為GF254。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，圖4 中北芪菇和正北芪樣液在相同位置處具有一樣的斑點，與圖5 中經(jīng)顯色的L - 硒代蛋氨酸標準品斑點對比幾乎處于同一位置。

經(jīng)計算圖4 所標注斑點的Rf值為0.587 和0.575，圖5 中L- 硒代蛋氨酸標準品斑點的Rf值為0.588。初步認為北芪菇和正北芪樣液中均含有硒代蛋氨酸。

需要進行表征來確定。

綜上所述，由圖1 到圖5 中Rf值大小可以看出，其一由于圖1，圖2 和圖3，圖4 和圖5 使用了不同的硅膠薄層版，其Rf值大小有差異屬于正常情況；其二是使用相同的硅膠薄層版，其Rf值大小有細微的差異，也屬于正常，因為可能與板的質量、展開劑的展開時間和室內(nèi)溫度都密切相關。但是需要作進一步的表征分析。

由圖4 可知，同時檢測的北芪菇菌糧中發(fā)現(xiàn)硒代氨基酸。

2.2 質譜檢測與表征

2.2.1 北芪菇質譜檢測與表征

L- 硒代蛋氨酸標準品質譜圖見圖6。

圖6 L- 硒代蛋氨酸標準品質譜圖

所有質譜圖都是用ESI 離子源測得，并且離子模式為雙離子模式。圖6 為L - 硒代蛋氨酸標準品的質譜圖，查閱參考文獻可知L - 硒代蛋氨酸的結構式為，相對分子質量為196.6。在圖譜中基峰的質荷比為195.9 m/z，因為硒代蛋氨酸含有氨基和羧基2 個官能團，在高溫轟擊狀態(tài)下-COOH 中很容易失去氫離子，因此圖譜中基峰的質荷比值比相對分子質量低1。

北芪菇提取液質譜圖見圖7，北芪菇提取液質譜圖見圖8。

圖7 北芪菇提取液質譜圖

圖7 和圖8 所選取的背景時間段相同，但所截取的測量時間段不同，如果2 幅圖片的峰值相同更能進一步證明該種物質結構是電擊轟離后的結構，而不是偶然所得。

圖7 和圖8 中出現(xiàn)的基峰質荷比分別為195.9 m/z和160 m/z 與L- 硒代蛋氨酸的標準品圖譜的基峰對比發(fā)現(xiàn)圖譜中的基峰相同，由此初步認為這些峰值為硒代蛋氨酸的峰值，其他的峰值有可能為經(jīng)過其他反應所得到物質的峰，也可能為雜質的峰。

圖8 北芪菇提取液質譜圖

2.2.2 北芪菇菌糧質譜檢測與表征

北芪菇菌糧提取液質譜圖見圖9，北芪菇菌糧提取液質譜圖見圖10。

圖9 北芪菇菌糧提取液質譜圖

圖10 北芪菇菌糧提取液質譜圖

圖9 和圖10 也是所選取的背景時間段相同，但所截取的測量時間段不同，如果2 幅圖片的峰值相同，更能進一步證明該種物質結構是電擊轟離后的結構，而不是偶然所得。

從圖9 和圖10 可以看出，這兩幅圖譜的峰較多且雜，從400 m/z 到700 m/z 不等，與標準品圖譜對比發(fā)現(xiàn)這兩圖譜沒有196 m/z 左右的峰值，所以認為沒有檢測到硒代氨基酸，這與薄層檢測所得出的結果也一致。

2.2.3 正北芪質譜檢測與表征

正北芪提取液質譜圖見圖11，正北芪提取液質譜圖見圖12。

圖11 正北芪提取液質譜圖

圖11 和圖12 均是也是所選取的背景時間段相同，但所截取的測量時間段不同，如果2 幅圖片的峰值相同更能進一步證明該種物質結構是電擊轟離后的結構，而不是偶然所得。

圖11 和圖12 均是正北芪提取液的質譜圖。與標準品質譜圖對比含有196 m/z 左右的峰值，初步認為這段峰值為硒代蛋氨酸的峰值。

綜上所述，通過質譜檢測與分析，北芪菇和正北芪樣液中均含與L - 蛋氨酸的質譜基線峰值，但僅此判斷它們就是L - 蛋氨酸還不夠，需要進一步通過紅外檢測其官能團，以確定北芪菇和正北芪樣液中硒代蛋氨酸。

2.3 紅外檢測與表征

L - 硒代蛋氨酸標準品（固體） 紅外檢測圖見圖13。

圖13 L- 硒代蛋氨酸標準品（固體)紅外檢測圖

由圖13 可知，在2 800～3 000 cm-1范圍內(nèi)只有1 個比較明顯的吸收峰，而在600～1 600 cm-1的范圍內(nèi)有許多比較明顯的吸收峰。根據(jù)硒代蛋氨酸的分子結構式可知其特征峰應為羧基、氨基和硒所顯示的峰值，查閱有關文獻可知，飽和C-H 鍵的吸收峰值位于2 800～3 000 cm-1；羧酸中C=O 伸縮吸收的峰值位于1 706～1 720 cm-1，C-O 伸縮吸收的峰值位于1 210～1 320 cm-1，O-H 伸縮吸收峰值位于2 500～3 300 cm-1，并且峰形寬而強；氨基中N-H 伸縮振動吸收的峰值位于3 100～3 500 cm-1，C－N 伸縮振動的峰值位于1 000～1 350 cm-1，N-H 變形振動吸收峰值位于1 560～1 640 cm-1，C-Se 鍵吸收峰值位于700 cm-1左右。

將這些特征峰的吸收峰值范圍與圖13 進行對比，發(fā)現(xiàn)在697 cm-1處有吸收峰，初步判斷含有C-Se 鍵，在2 918 cm-1處有個明顯的吸收峰，可初步判斷為C-H 鍵的伸縮振動引起，在1 219 cm-1有明顯的吸收峰可初步判斷為羧酸中的C-O 鍵，在1 344 cm-1處有吸收峰初步判斷為氨基中的C-N 鍵，在1 566 cm-1處有吸收峰初步判斷為氨基中的N-H鍵；除此之外，位于1 604 cm-1處的吸收峰可能為C-H 鍵彎曲振動引起，以上所述峰值為硒代蛋氨酸的特征峰值。

L- 硒代氨基酸（液態(tài)） 標準品紅外圖見圖14。

圖14 L- 硒代氨基酸(液態(tài))標準品紅外圖

圖14 是L- 硒代蛋氨酸標準品液體的紅外圖譜，溶劑為色譜甲醇，因此與固體標準品圖譜相比有較大的差異，在3 200～3 400 cm-1范圍內(nèi)有個很寬的吸收峰，查閱有關資料判斷為-OH 峰。在1 645 cm-1處有較明顯的吸收峰，可判斷為由N－H 變形振動引起，在1 014 cm-1處的吸收峰可判斷為C-N 鍵伸縮振動引起。

北芪菇L - 硒代氨基酸紅外圖見圖15，正北芪提取液紅外圖見圖16，北芪菇菌糧提取液紅外圖見圖17。

圖15、圖16 和圖17 分別為北芪菇、正北芪和北芪菇菌糧樣液紅外掃描圖。將3 幅圖譜與L - 硒代氨基酸液體標準品圖譜和固體標準品圖譜進行對比發(fā)現(xiàn)，整個圖譜的走勢大致相同，但是圖15、圖16 和圖14 的特征吸收峰大致相似，在1 640，1 340，1 030，700 cm-1左右都有吸收峰，由此可確定北芪菇和正北芪中含有L- 硒代蛋氨酸。

圖15 北芪菇L- 硒代氨基酸紅外圖

圖16 正北芪提取液紅外圖

圖17 北芪菇菌糧提取液紅外圖

圖17 北芪菇菌糧樣液紅外掃描圖，沒有相似的吸收峰。

2.4 紫外檢測與分析

L- 硒代蛋氨酸標準品紫外掃描圖見圖18。

圖18 L- 硒代蛋氨酸標準品紫外掃描圖

由圖18 可知，L- 硒代蛋氨酸標準品在214 nm處有最大吸收峰，查閱文獻可知L - 硒代蛋氨酸在220 nm 左右有最大吸收峰，所測結果與其相符。

L- 硒代蛋氨酸標準品檢測結果見表1，樣品紫外檢測結果見表2。

表1 L- 硒代蛋氨酸標準品檢測結果

表2 樣品紫外檢測結果

按表1 設置質量濃度梯度，經(jīng)標準品質量濃度梯度測量得到一條標準曲線。

L- 硒代蛋氨酸標準品標準曲線圖見圖19。

圖19 L- 硒代蛋氨酸標準品標準曲線圖

由表2 可知，L - 硒代蛋氨酸質量濃度分別為0.04，0.07 mg/mL，經(jīng)計算北芪菇中硒代蛋氨酸的含量為0.24%，正北芪中硒代蛋氨酸含量為0.42%。

2.5 比旋度、旋光度和熔點測定

L- 硒代蛋氨酸標準品的旋光度見表3，北芪菇L- 硒代蛋氨酸的旋光度見表4，正北芪L- 硒代蛋氨酸的旋光度見表5。

表3 L- 硒代蛋氨酸標準品的旋光度

表4 北芪菇L- 硒代蛋氨酸的旋光度

表5 正北芪L- 硒代蛋氨酸的旋光度

由表3、表4 和表5 可知，L- 硒代蛋氨酸標準品、北芪菇和正北芪提取液的比旋光度分別為18.05，18.39，18.25；旋光度分別為 18.80，18.34，18.67。出現(xiàn)差異的原因可能與手動刮板、硅膠板質量以及雜質干擾相關。

經(jīng)測量北芪菇提取液的結晶熔點分別為268，265，266，平均值約為266；正北芪提取液的結晶熔點分別為266，265，266，平均值約為266；L - 硒代蛋氨酸標準品的結晶熔點為265，267，267，平均值約為266。

3 結論

以北芪菇、北芪菇菌糧和正北芪為原料，稀硝酸使蛋白質沉淀變性，用胰蛋白酶（15 mg） 和蛋白酶K（15 mg） 分解蛋白質，分解時間36 h，離心過濾獲得待測樣液。

展開（正丁醇∶乙酸∶水（7∶1∶2，V/V）） 和顯色后，北芪菇和正北芪浸提液紫色斑點中有1 個與硒代蛋氨酸標準品斑點位置一致，其Rf值為0.368；北芪菇菌糧中未見清晰斑點。

質譜檢測顯示，北芪菇和正北芪樣液和硒代蛋氨酸標準品基峰質荷比（m/z） 均為196 m/z；紅外光譜分析顯示，北芪菇和正北芪樣液和硒代蛋氨酸標準品均含有N-H、O-H、C-O、C-N、C-Se 等功能團；北芪菇和正北芪樣液中硒代蛋氨酸含量分別為0.24%和0.42%。

北芪菇和正北芪提取液L - 硒代蛋氨酸標準品的結晶熔點均為266；L- 硒代蛋氨酸標準品、北芪菇和正北芪提取液的比旋光度分別為18.05，18.39，18.25；旋光度分別為18.80，18.34，18.67。

質譜法是一種鑒定這些斑點的強大技術，然而傳統(tǒng)的從薄層板上手動刮點、萃取、重組，進而在質譜上注射分析獲取質譜圖的過程耗時耗力。Plate Express TM 是一種直接從TLC 薄層板上獲取質譜圖，提供簡單、自動化方法的設備，使用這項技術甚至可以不經(jīng)過樣品前處理，快速在復雜混合物中鑒定出產(chǎn)品。