陶志東，王致遠，甘 雨，馬娜娜，馬海銳，冉 權，李富貴，馬 俊，丁功濤，鐵文軍，謝雕雕

（1. 西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730000；2. 西北民族大學生物醫(yī)學研究中心，甘肅蘭州 730000；3. 臨夏市俊林清真肉制品有限責任公司，甘肅臨夏 731100；4. 甘肅綠能農業(yè)科技股份有限公司，甘肅天祝 733200）

0 引言

我國是畜禽生產大國，根據國家統(tǒng)計局統(tǒng)計數據，2018 年中國牛、羊、豬、雞的畜禽屠宰數分別為4 397.4 萬頭，31 010.4 萬只，69 382 萬頭，790 000 萬羽。據估算，牛、羊、豬、雞的屠宰血液量分別為 8 6.7 萬 t ，65.6 萬 t ，499 萬 t ，169 萬 t 。畜禽屠宰后的血液，除極少數用作工業(yè)原料及制成蛋白飼料外，大部分的血液作為廢棄物被排放，造成了屠宰場周圍土壤和空氣的污染，產生了巨大的環(huán)境壓力；傳統(tǒng)血液通過蒸煮、壓榨、烘干后粉碎的方法加工，得到的產品吸收利用率低、生物安全性差，其中的血液蛋白沒有得到有效利用且造成資源的浪費。因此，如何有效地處理屠宰場的血液廢棄物成為了迫切解決的問題。

畜禽廢棄血液的微生物降解是解決污染與蛋白有效利用的途徑，能實現對血液蛋白的綜合利用及提高產品的附加值，有效增加動物源性蛋白原料的供給和提高利用率。由于投入成本低、能源消耗少，蛋白質多肽和氨基酸含量較高[1]，有降解蛋白廢棄物以制備氨基酸水溶肥的潛力。

目前，研究的血液蛋白降解菌株主要有金黃色節(jié)桿菌（Arthobacter aurescens）、蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、短小芽孢桿菌 （Bacillus pumilus） 和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） 等[2-9]。這些篩選的菌株的蛋白降解率為20.25%～75.00%，測得的酶活力約為14～1 220.6 U/mL，酶解后的酶解液中可溶性蛋白質含量約為2.69%～290.00%，游離氨基酸含量約為0.98%～3.07%；在培養(yǎng)基上生長的透明圈DC 值范圍為1.65～14.00[2-9]。研究的目標菌株均對屠宰血液廢棄物有一定的分解作用，目前對屠宰廢棄血液研究的方向更多是制作動物蛋白飼料，對微生物發(fā)酵生產氨基酸水溶肥方面研究較少。

國內外對牦牛血液蛋白降解菌的分離篩選研究較少，從屠宰場血液廢棄物中分離出高效降解牦牛血液蛋白的菌株，并對其進行酶活力測定和分子生物學鑒定，旨在為畜禽廢棄血液資源的合理利用、發(fā)酵生產氨基酸水溶肥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

菌株分離基質采自西藏日喀則市江孜縣英雄路6 號屠宰場土壤，E89°60′92.18″， N28°91′00.74″。

1.1.2 試劑

蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉、福林酚試劑，博精索拉博科技有限公司提供；NaCl、CaCl2，天津市大茂化學試劑廠提供；酵母提取物、胰蛋白胨，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠提供；葡萄糖，國藥集團化學試劑有限公司提供；MgSO4、KH2PO4、FeSO4，天津市百世化工有限公司提供；Na2HPO4，天津市北辰方正試劑廠提供；新生牛血清，蘭州民海生物工程有限公司提供；ZnCL2，天津市風船化學試劑科技有限公司提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

基礎培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂10 g/L，血清 3%，pH 值 7.2～7.4。

富集培養(yǎng)基。LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 值7.5。

蛋白篩選培養(yǎng)基。哥倫比亞血瓊脂平板培養(yǎng)基：酪蛋白胰酶消化物、玉米淀粉、瓊脂、新胰酶消化物、酵母浸出物、氯化鈉、肉胃酶消化物、脫纖維羊血、蒸餾水，pH 值7.5。

酪蛋白培養(yǎng)基：KH2PO40.3 g/L，MgSO40.5 g/L，ZnCl20.014 g/L， NaCl 0.6 g/L， CaCl20.002 g/L，Na2HPO4·7H2O 1.07 g/L，FeSO40.002 g/L，酪蛋白4 g/L，胰蛋白胨0.05 g/L，瓊脂15 g/L，pH 值6.5～7.0。

1.1.4 儀器設備

SW-CJ-1F 型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司產品；YXQ-LS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司產品； PCR 擴增儀，德國Biometra 公司產品；IS-ROV1 型立式恒溫振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司產品；DK-S24 型恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司產品；Pico17 型高速離心機，熱電發(fā)光二級管有限公司產品；1800PC 型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產品；DYY-6D 型電泳儀電源，廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司產品；CKX53 型生物倒置顯微鏡，奧林巴斯產品；MJ-25OF-1 型霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 分離純化

取5 g 土樣加入到裝有無菌水的錐形瓶中，于恒溫振蕩器中以轉速120 r/min 于37 ℃下培養(yǎng)12 h。

取培養(yǎng)上清液5 mL 加入到LB 液體培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)，于振蕩器中以轉速150 r/min 37 ℃下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束時可用肉眼觀察液體培養(yǎng)基是否變混濁，初步判斷菌株是否發(fā)生增殖。

（1） 分離培養(yǎng)。吸取1 mL 富集培養(yǎng)液溶于9 mL無菌水中配成10-1菌懸液，再逐步稀釋至10-6級數的菌懸液，取50 μL 加入到基礎培養(yǎng)基的平皿上，采用稀釋涂布法將菌液均勻涂布，于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后觀察培養(yǎng)平皿上菌落的種類和數量。

（2） 劃線分離培養(yǎng)（初篩）。從培養(yǎng)后的平皿中挑取單個菌落，在基礎培養(yǎng)基上采用劃線分離培養(yǎng)法進行純化培養(yǎng)，于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察其生長情況。純化操作可重復3～5 次，直到其能在基礎培養(yǎng)基上分散成單個菌落生長。將純化后的菌株參考文獻[10]方法進行保藏，并選出菌落直徑較大的菌株，進行下一步菌株的測定。

1.2.2 蛋白降解效果測定

（1） 酪蛋白分解能力（復篩）。取在基礎培養(yǎng)基上培養(yǎng)明顯的單個菌落，用無菌接種環(huán)蘸取少量菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，置于恒溫振蕩器中，以轉速150 r/min 在37 ℃下培養(yǎng)24 h。

采用打孔法在酪蛋白培養(yǎng)基上均勻打孔，取部分培養(yǎng)后的菌液，以每孔50 微升用移液槍進行加樣，于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察菌種透明圈比值大小，初步判斷菌株對蛋白質的分解能力，以確定該菌是否是所需的目標菌株。

（2） 血紅蛋白降解能力。采用相同的方法在血瓊脂平板上均勻打孔后加入適量菌液，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌種透明圈比值大小。經培養(yǎng)后培養(yǎng)基上的水解透明圈直徑越大，說明產酶能力越好且酶活力越高[9-11]。

1.2.3 形態(tài)學鑒定

選擇在血瓊脂平板培養(yǎng)基上透明圈明顯的單個菌落進行觀察，觀察菌落的大小、形態(tài)、顏色、邊緣、透明度和隆起程度，同時取部分菌落進行革蘭氏染色后鏡檢，在光學顯微鏡的油鏡下觀察菌落細胞的形態(tài)和染色情況[12]。

1.2.4 生理生化鑒定

將在血瓊脂平板上純化后得到的單個菌落接種于斜面固體培養(yǎng)基活化，對活化后的菌株進行生理生化鑒定，主要從菌株對碳源和氮源的利用、硝酸還原、枸櫞酸鹽利用、氨基酸生成、硫化氫產生等方面來進行分析，根據分析所得結果，對照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]進行種屬鑒定。

1.2.5 分子生物學鑒定

微生物菌株的16SrDNA 序列片段是鑒定物種的一個重要指標，通過使用試劑盒對菌株的總DNA 的抽提和引物的設計，將該菌成功進行PCR 擴增，并有效回收凝膠片段，送入生物公司完成測序。

（1） PCR 模板的制備。菌株 NwMcc01910045 的總DNA 提取和16SrRNA 的擴增方法參照文獻[14]。試驗采用的引物為27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'； 1492R： 5 GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。將試劑盒中合成的引物干粉經離心加無菌水后制成引物的工作液。

（2） PCR 反應體系的配制。

PCR 反應體系見表1。

表1 PCR 反應體系

PCR 反應條件：94 ℃ 預變性4 min；94 ℃變性30 s；56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 3 min，共 30 次循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

（3） PCR 產物電泳及測序。配置質量分數為0.8%的瓊脂糖凝膠塊，取2～3 μL PCR 產物在120 V電泳15～20 min，觀察溴酚藍指示劑在膠塊中的位置。電泳結束后，取出凝膠塊并在紫外線成像儀下觀察各PCR 擴增產物在膠塊中的位置，參照DNA Marker 確定各產物的分子大小。

將電泳結果正確（16SrDNA 全長為1 500 bp 左右） 的孔道所對應的PCR 樣品送入相應的生物測序公司進行測序，將測序送回的序列經拼接后使用。

（4） 建立系統(tǒng)發(fā)育樹。將拼接好的16S rRNA 全長序列在NCBI 的Nucleotide 數據庫中進行BLAST 序列比對，與Genebank 中已知的16S rDNA 進行同源性比較。將分離菌株的16S rDNA 核酸序列和BLAST結果中的序列通過軟件MEGA7.0 進行多重比對并采用Neighbor-Joining 方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 蛋白酶活力測定

粗酶液制備。將分離純化后所得的單菌落，用接種環(huán)取少量至富集培養(yǎng)基中活化，于振蕩器中37 ℃下以轉速150 r/min 培養(yǎng)18～20 h；取活化后的菌液2 mL 于離心機中以轉速10 000 r/min 離心10 min，棄去沉淀所得的上清液即為所需的粗酶液。

蛋白酶活力的測定。采用GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》法[15]。設置試驗組和空白組，分別反應后采用紫外- 可見分光光度計于波長660 nm 處測定吸光度。

蛋白酶活力。采用福林酚法，在40 ℃，pH 值7.5 下水解酪蛋白以產生1 μg 酪氨酸所需的酶量被定義為一種蛋白酶活性單位。

計算：

式中：X3——樣品的酶活力，μ/g；

A1——由標準曲線得出的樣品最終稀釋液的活力，μ/mL；

V1——溶液樣品所使用的容量瓶的體積，mL；

4——反應試劑的總體積，mL；

n1——樣品的稀釋倍數；

m4——樣品的質量，g；

1/10——反應時間10 min，以1 min 計。

2 結果與分析

2.1 蛋白分解菌分離和篩選結果

菌株的分離篩選：初步獲得1 株純化菌株編號為NwMcc01910045。

酪蛋白篩選得到的透明圈見圖1。

圖1 酪蛋白篩選得到的透明圈

由圖1 可知，菌株在酪蛋白培養(yǎng)基上生長良好且在菌落旁形成較大透明圈，證明該菌具備一定蛋白質的降解能力。

哥倫比亞血平板篩選得到的透明圈見圖2。

圖2 哥倫比亞血平板篩選得到的透明圈

蛋白質水解圈大小是衡量菌株產蛋白酶及降解血紅蛋白能力的一個重要指標。蛋白質水解圈越大，說明該菌株所產蛋白酶的活力越高，降解血紅蛋白的能力也就越強[16]。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定

菌落形態(tài)呈橢圓型，表面光滑潮濕，菌落呈黃色且不透明，邊緣呈顆粒狀半透明，長于培養(yǎng)基表面，菌落大小為1.8～2.4 mm。

通過革蘭氏染色法，編號為NwMCC01910045 的菌株呈紅色短桿狀。

菌株NwMCC01910045 革蘭氏染色結果見圖3。

圖3 菌株NwMCC01910045 革蘭氏染色結果

2.2.2 生理生化特性

生化性質見表2。

根據菌株NwMCC01910045 的菌落形態(tài)、生理生化反應及革蘭氏染色結果，按《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》初步鑒定為吉氏庫特菌屬（Kurthia sp.）。

2.2.3 分子生物學鑒定

（1） PCR 擴增電泳圖。將分離純化后的革蘭氏陰性菌的菌液直接進行PCR 擴增反應。

PCR 擴增產物見圖4。

由圖4 可知，最左邊依次為Marker 的條帶組成，電泳方向從上往下。擴增結果表明菌株NwMcc01910045擴增的目的條帶大小為1 500 bp 左右。

表2 生化性質

圖4 PCR 擴增產物

（2） 系統(tǒng)發(fā)育分析。將菌株NwMcc01910045 送樣分析后得到的16S rDNA 序列，在NCBI 上使用BLAST 軟件將該序列與Genebank 數據庫中已報道的16S rDNA 序列進行同源性比較。結果顯示，菌株NwMcc01910045 與吉氏庫特菌菌屬（Kurthia sp.） 的序列同源性較高。將獲得的NwMcc01910045 菌株和BLAST 結果中的15 條核酸序列，使用MEGA7.0 進行多重比對并繪制了系統(tǒng)進化樹。

菌株NwMcc01910045 的系統(tǒng)進化樹見圖5。

圖5 菌株NwMcc01910045 的系統(tǒng)進化樹

由圖5 可知，NwMcc01910045 與吉氏庫特菌位于同一個分支上，同源性達到99.9%，具有較近的遺傳距離，在生理生化鑒定時可基本斷定其為吉氏庫特菌。再根據革蘭氏染色和生理生化鑒定等試驗結果進行綜合分析，確定將NwMcc01910045 菌株歸屬于吉氏庫特菌菌屬（Kurthia sp.）。

2.3 蛋白酶活力測定

酪氨酸標準曲線見圖6。

圖6 酪氨酸標準曲線

2.4 蛋白酶活力

經試驗測定得，菌株NwMcc01910044 的蛋白酶活力測定結果為88.69 U/mL。

3 結論

通過對屠宰場血液廢棄物的分離純化，從樣品中篩選出1 株能在蛋白質培養(yǎng)基上良好生長的菌株，編號為NwMCC01910045，保藏于西北微生物菌種保藏中心。該菌表面光滑潮濕，菌落呈黃色不透明，邊緣呈顆粒狀半透明。通過生理生化鑒定該菌對糖降解沒有反應，可產生DNA 酶，硝酸鹽未還原，枸櫞酸鹽陽性，硫化氫陰性，對賴氨酸和鳥氨酸反應。經系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現，菌株NwMCC01910045 與吉氏庫特菌（Kurthia sp.） 的16S rRNA 的同源性較高，結合生理生化鑒定和菌落形態(tài)初步認定該菌為吉氏庫特菌。酶活力大小為88.69 U/mL，是一株能高效降解蛋白質的菌株。

目前，對吉氏庫特菌的研究較少，已知吉氏庫特菌對頭孢拉啶等27 種藥物高度敏感[17]；對微囊藻毒素降解范圍為24.5%～62.2%[18]；相比于NO1 菌株、B3 菌株分別于添加羽毛粉、豬血粉的培養(yǎng)基上生長，酶活力分別為 14 U/mL，1 220.6 U/mL[8-9]；試驗NwMCC01910045 菌株于添加血液蛋白的血瓊脂平板上生長，酶活力比NO1 菌株高74.69 U/mL，而比B3菌株低1 131.91 U/mL。證明試驗分離純化得到的吉氏庫特菌，具有降解屠宰血液廢棄物以制備氨基酸水溶肥的潛力。

現有對蛋白降解菌株的研究已涉及基因工程、細胞工程等方向的新型生物技術手段，旨在提供一種可行的實驗室分離純化方法，從屠宰場的土壤中分離純化得到對蛋白質具有降解能力的菌株。試驗未對菌株的致病性、藥物敏感性等生物安全性方面進行評價，尚且停留在實驗室研究的初級階段。項目后續(xù)將開展菌株NwMCC01910045 對土壤血污中血紅蛋白的降解特性、降解產物氨基酸分析及降解工藝優(yōu)化試驗。