葛瑞宏，李鵬沖，王 永，王法云，王 慧

（1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，上海市轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心- 食品安全與毒理學(xué)評價(jià)中心，上海 200025；2. 河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，河南鄭州 450002；3. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

糖尿病是由于胰島素分泌不足或機(jī)體抵抗胰島素作用而引起的以高血糖為特征的代謝性疾病，是威脅人類健康的慢性疾病之一[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，高糖高脂日常飲食加之各種因素的共同作用使得糖尿病患病人數(shù)逐年增加。據(jù)2013 年中國慢性疾病監(jiān)測數(shù)據(jù)，18 歲及以上人群糖尿病患病率高達(dá)10.4%[2]。2014 年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界約8.5%的人口患有糖尿病，即有4.22 億糖尿病患者[3]。持續(xù)性高血糖可引起血管損害、功能和代謝障礙，產(chǎn)生多種并發(fā)癥，防治糖尿病已刻不容緩。

苦蕎（Fagopyrum tataricum（L.） Gaerth.），又稱韃靼苦蕎，是蓼科（Polygobaceae） 蕎麥屬（Fagopyrum） 一年生草本雙子葉植物[4]。近年來，苦蕎由于其獨(dú)特的營養(yǎng)價(jià)值和突出的醫(yī)藥保健功能引起國內(nèi)外農(nóng)業(yè)、食品營養(yǎng)及醫(yī)學(xué)界專家學(xué)者的廣泛關(guān)注和研究興趣[5-8]?？嗍w不僅營養(yǎng)成分豐富，還含有多種生物活性成分[9]。蘆丁及其衍生物具有重要的藥理學(xué)活性，是苦蕎降血糖功效成分[10]?？嗍w根據(jù)品種的不同分為黑苦蕎和黃苦蕎，黑苦蕎中蘆丁含量是黃苦蕎的3～5 倍[11]。試驗(yàn)以基于黑苦蕎黃酮的膠囊產(chǎn)品為研究對象，通過其對四氧嘧啶所致高血糖小鼠的降血糖作用，評價(jià)其降血糖功能，為黑苦蕎保健食品開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黑苦蕎膠囊樣品由實(shí)驗(yàn)室研制[12]：以黑苦蕎為原料，采用超聲波輔助乙醇回流提取黃酮成分，經(jīng)真空濃縮、真空干燥得苦蕎黃酮粉，按適當(dāng)比例添加微晶纖維素、硬脂酸鎂等輔料，再經(jīng)制粒、過篩和灌裝得黑苦蕎膠囊。相同工藝條件下制備3 批次樣品用于動(dòng)物試驗(yàn)，產(chǎn)品批號(hào)為20180831，20180903，20180905，置陰涼干燥處保存。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF 級(jí)昆明小鼠26±2 g 90 只，雄性，試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬） 2018-0004，合格證號(hào)：No.311620400017897；動(dòng)物維持飼料生產(chǎn)許可證號(hào)：蘇飼證（2017） 05005，上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供；屏障動(dòng)物房試驗(yàn)條件：溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%。

1.3 儀器與試劑

四氧嘧啶 （C4H2N2O4·H2O），美國 Sigma 公司產(chǎn)品；Freestyle Freedom Lite 血糖儀、血糖試紙（葡萄糖脫氫酶法），雅培貿(mào)易（上海） 有限公司產(chǎn)品；UW820S 型電子天平，島津國際貿(mào)易（上海） 有限公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 體重測定

采用電子天平進(jìn)行試驗(yàn)小鼠體重稱量，每次稱量前禁食4 h（不禁水）。

1.4.2 動(dòng)物分組

購入雄性昆明小鼠90 只，適應(yīng)1 d 后，禁食4 h（自由飲水）。稱量體重，取尾靜脈血測定其空腹血糖值作為該批次動(dòng)物基礎(chǔ)血糖值。隨機(jī)分為正常組和模型組兩大組。其中，正常組動(dòng)物30 只，每組15 只，標(biāo)記為正?？瞻捉M和正常高劑量組；模型組動(dòng)物60 只，造模成功后按血糖水平再隨機(jī)分為模型對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，以實(shí)際造模成功的動(dòng)物數(shù)量記錄試驗(yàn)結(jié)果，每組動(dòng)物數(shù)量不低于10 只。

1.4.3 劑量選擇與受試物給予方式

根據(jù)受試樣品人體推薦攝入量2.7 g / 人/ 日（按60 kg 體重計(jì)），設(shè)低劑量0.225 g/kg·bw/d，中劑量 0.45 g/kg·bw/d，高劑量 1.35 g/kg·bw/d 3 個(gè)劑量組（分別相當(dāng)于人體推薦攝入量的5 倍，10 倍，30 倍），同時(shí)設(shè)模型對照組（0 g/kg·bw/d），另設(shè)正常動(dòng)物的受試樣品組（高劑量1.35 g/kg·bw/d） 和空白對照組（0 g/kg·bw/d）。受試樣品（黑苦蕎膠囊內(nèi)容物） 用蒸餾水配制，低、中、高劑量組配制質(zhì)量濃度分別為45，90，270 mg/mL，空白對照組 （0 g/kg·bw/d） 及模型對照組（0 g/kg·bw/d） 以蒸餾水代替受試物，經(jīng)口每日1 次給予小鼠相應(yīng)質(zhì)量濃度的受試樣品，小鼠灌胃量為5 mL/kg·bw，連續(xù)灌胃30 d，每周稱1 次小鼠體重調(diào)整灌胃量。第31 天禁食4 h 后測空腹血糖。

1.4.4 高血糖模型動(dòng)物造模方法

模型組動(dòng)物禁食24 h（自由飲水），用低溫下4 ℃無菌生理鹽水配制的13 mg/mL 四氧嘧啶以1 mL/100 g·bw 腹腔注射造模。飼養(yǎng) 5～7 d 后小鼠禁食4 h 進(jìn)行血糖值的測定，血糖值達(dá)10～25 mmol/L即為高血糖模型造模成功的動(dòng)物[13]。

1.4.5 糖尿病模型動(dòng)物降血糖試驗(yàn)

試驗(yàn)前按照1.4.2 對高血糖模型小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組。各劑量組依據(jù)小鼠體重及灌胃量要求給予黑苦蕎降血糖膠囊受試物，連續(xù)灌胃30 d，每周測1 次體重，根據(jù)體重調(diào)整灌胃量。模型對照組灌胃相應(yīng)溶劑。試驗(yàn)結(jié)束，進(jìn)行空腹血糖值的測定。血糖下降率計(jì)算公式如下[13]：

1.4.6 糖尿病模型動(dòng)物糖耐量試驗(yàn)

首先，對各劑量組動(dòng)物進(jìn)行空腹血糖值的測定，記錄0 h 血糖值；各劑量組灌胃不同濃度的黑苦蕎降血糖膠囊，模型對照組灌胃相同體積的溶劑，20 min后按照2.0 g/kg·bw 灌胃葡萄糖溶液，記錄時(shí)間，分別在0.5，2 h 后測定血糖值，計(jì)算血糖曲線下面積，計(jì)算公式如下[14-15]：

正常組動(dòng)物糖耐量試驗(yàn)與1.4.6 相同。

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2010 和GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差 （SD） 表示。

1.6 結(jié)果判定

依據(jù)“關(guān)于印發(fā)抗氧化功能評價(jià)方法等9 個(gè)保健功能評價(jià)方法的通知（國食藥監(jiān)?；痆2012]107 號(hào)）”中“輔助降血糖功能評價(jià)方法”進(jìn)行結(jié)果判定[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑苦蕎膠囊對正常小鼠體重的影響

黑苦蕎膠囊對正常小鼠體重的影響見表1。

表1 黑苦蕎膠囊對正常小鼠體重的影響（X±s）

由表1 可知，與灌胃溶劑的空白組相比，正常組小鼠灌胃高劑量黑苦蕎膠囊后其體重在試驗(yàn)初始（0 d）、中期 （15 d） 和后期 （30 d） 未出現(xiàn)明顯差異 （p＞0.05）。

2.2 黑苦蕎膠囊對正常小鼠空腹血糖的影響

黑苦蕎膠囊對正常小鼠空腹血糖的影響見表2。

表2 黑苦蕎膠囊對正常小鼠空腹血糖的影響（X±s）

由表2 可知，與正?？瞻捉M相比，正常組小鼠高劑量灌胃受試物后，試驗(yàn)初始（0 d）、中期（15 d） 和后期（30 d） 的空腹血糖值未出現(xiàn)明顯差異 （p＞0.05）。

2.3 黑苦蕎膠囊對正常小鼠糖耐量的影響

黑苦蕎膠囊對正常小鼠糖耐量的影響見表3。

表3 黑苦蕎膠囊對正常小鼠糖耐量的影響（X±s）

由表3 可知，正常高劑量組與正常空白組相比，糖耐量無明顯差異（p＞0.05）。

2.4 黑苦蕎膠囊對高血糖模型小鼠體重的影響

黑苦蕎膠囊對高血糖模型小鼠體重的影響見表4。

表4 黑苦蕎膠囊對高血糖模型小鼠體重的影響（X±s）

由表4 可知，與高血糖模型對照組相比，各劑量組小鼠體重在試驗(yàn)初始（0 d）、中期（15 d） 和后期 （30 d） 未出現(xiàn)明顯差異 （p＞0. 05）。

2.5 黑苦蕎膠囊對高血糖模型小鼠空腹血糖的影響

黑苦蕎膠囊對高血糖模型小鼠空腹血糖的影響見表5。

表5 黑苦蕎膠囊對高血糖模型小鼠空腹血糖的影響（X±s）

由表5 可知，經(jīng)口給予高血糖模型小鼠低、中、高不同劑量的黑苦蕎膠囊，連續(xù)30 d 后對各組動(dòng)物的空腹血糖值進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，與未灌胃受試物的模型對照組比較，不同劑量組小鼠空腹血糖值均顯著下降 （p＜0.05）。

2.6 黑苦蕎膠囊對高血糖模型小鼠糖耐量的影響

黑苦蕎膠囊對高血糖模型小鼠糖耐量的影響見表6。

由表6 可知，與模型對照組比較，中劑量小鼠血糖曲線下面積顯著降低（p＜0.05），低劑量小鼠血糖曲線下面積降低極顯著（p＜0.01）。

表6 黑苦蕎膠囊對高血糖模型小鼠糖耐量的影響（X±s）

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用CFDA 于2012 年發(fā)布的有關(guān)保健食品功能評價(jià)方法（國食藥監(jiān)?；痆2012]107 號(hào)），其對“輔助降血糖功能評價(jià)方法”結(jié)果判定做出規(guī)定，要求2 項(xiàng)檢測指標(biāo)空腹血糖、糖耐量中至少一項(xiàng)呈現(xiàn)陽性，同時(shí)對于血糖正常動(dòng)物的空腹血糖值沒有任何不良影響，才可判定該受試物具有輔助降血糖功能。試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，血糖正常組動(dòng)物灌胃黑苦蕎膠囊后體重、空腹血糖未出現(xiàn)任何異?，F(xiàn)象，與糖尿病模型對照組比較，灌胃不同劑量黑苦蕎膠囊小鼠的血糖下降率明顯增加（p＜0.05）。糖耐量試驗(yàn)中，低劑量組和中劑量組小鼠血糖曲線下面積顯著降低（p＜0.01，p＜0.05）。由此可以判定，黑苦蕎膠囊輔助降血糖功能動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果為陽性。

4 討論

現(xiàn)有研究結(jié)果表明，苦蕎降血糖作用主要是通過抑制ɑ - 葡萄糖苷酶、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt） 信號(hào)通路等實(shí)現(xiàn)的[16]。ɑ - 葡萄糖苷酶抑制劑作用原理為苦蕎活性成分對消化道內(nèi)的ɑ - 葡萄糖苷酶產(chǎn)生了抑制作用，降低了淀粉的分解速度，使得葡萄糖濃度降低，減緩消化道對其吸收，降低餐后血糖值。目前，因其獨(dú)特的優(yōu)勢已被廣泛應(yīng)用于臨床糖尿病治療中。Calzada F 等人[17]研究結(jié)果表明，蘆丁能夠改善糖尿病患者的胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂，促進(jìn)人體內(nèi)的胰島素分泌，提高胰島素受體親和力，具有顯著降血糖功能。晚期糖基化終產(chǎn)物（Advanced Glycation Endproducts AGEs） 被認(rèn)為是由還原糖類與體內(nèi)其他營養(yǎng)成分的氨基部分發(fā)生非酶促反應(yīng)后形成的物質(zhì)，含量過高就有可能致病。AGEs 與糖尿病等慢性疾病密切相關(guān)，糖尿病患者組織中的AGEs 含量較高[18]。Lee C C 等人[19]研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎醇提物和蘆丁能夠通過抑制果糖胺和α - 二羰基化合物降低AGEs的產(chǎn)生。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)苦蕎醇提物、蘆丁和槲皮素能夠通過促進(jìn)Akt 磷酸化作用并激活PPARγ 改善肝細(xì)胞葡萄糖攝取[20]。此外，苦蕎提取物在保護(hù)肝細(xì)胞蛋白磷酸化有胰島素類似物的作用。蘆丁被發(fā)現(xiàn)還能夠通過刺激大鼠胰腺β 細(xì)胞中胰島素受體底物- 2 信號(hào)通路緩解β 細(xì)胞糖毒性。因此，蘆丁在維持Ⅱ型糖尿病人胰島素信號(hào)傳導(dǎo)方面具有內(nèi)在保護(hù)作用。

中國是蕎麥主產(chǎn)國，據(jù)FAO 統(tǒng)計(jì)，2017 年世界蕎麥種植面積394 萬hm2，總產(chǎn)量383 萬t。其中，中國蕎麥種植面積168 萬hm2，總產(chǎn)量145 萬t，占世界蕎麥總種植面積和總產(chǎn)量的42.7%，37.8%，分居第一、第二位，苦蕎資源得天獨(dú)厚。同時(shí)，中國也是糖尿病患者最多的國家之一，開發(fā)苦蕎降血糖保健食品不僅能夠更好地利用我國現(xiàn)有天然降血糖資源，對健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展也具有一定的意義。