馬 芹 ， 許明清 ， 汪建華 ， 趙 杰 ， 張中波 ， 石艷紅 ， 李玉峰 ， 張秀美

(1. 山東和康源生物育種股份有限公司 ， 山東 濟(jì)南 250102 ； 2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 ， 山東 濟(jì)南 250031 ；3. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 山東 濟(jì)南 250100)

新型鴨呼腸孤病毒(Novel duck reovirus，NDRV)感染最早發(fā)生在我國(guó)南方地區(qū)，北方較少報(bào)道[1-3]，自2015年開(kāi)始，北方櫻桃谷鴨的NDRV檢出率明顯增高[4-5]。近2年，NDRV在山東地區(qū)的櫻桃谷鴨中廣泛流行，主要引起雛鴨精神沉郁、食欲廢絕，消瘦，跗關(guān)節(jié)腫脹、腿軟等一些特征性的癥狀[6-8]，料肉比明顯升高，剖檢可見(jiàn)脾臟出血、壞死，機(jī)體免疫力下降，進(jìn)而繼發(fā)感染導(dǎo)致較高的死亡率[9]；同時(shí)關(guān)節(jié)腫脹、瘸腿現(xiàn)象較為嚴(yán)重，造成了較高的淘汰率，給養(yǎng)殖帶來(lái)了巨大困擾。近日，山東菏澤櫻桃谷部分鴨出現(xiàn)脾臟壞死、瘸腿癥狀，本課題組通過(guò)對(duì)8個(gè)鴨養(yǎng)殖區(qū)進(jìn)行調(diào)研，了解到腿病主要發(fā)生于6～8周齡的雛鴨，并且發(fā)病鴨大多表現(xiàn)脾臟異常，據(jù)此初步懷疑與新型鴨呼腸孤病毒有關(guān)。本試驗(yàn)從病死鴨中采集肝臟、脾臟，進(jìn)行病原的分離鑒定、純化培養(yǎng)及致病性分析，探究新型鴨呼腸孤病毒是否為引發(fā)脾臟壞死、瘸腿癥狀的原因，以期為該病的綜合防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料 山東菏澤地區(qū)商品肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)10日齡發(fā)病鴨。

1.2 試驗(yàn)用雞胚、動(dòng)物、細(xì)胞 7日齡SPF雞胚，購(gòu)自山東斯帕法斯公司；1日齡商品鴨、35周齡健康櫻桃谷種鴨，均購(gòu)自山東和康源生物育種股份有限公司；Vero細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 主要儀器與試劑 PCR儀，購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。RNA提取試劑盒，購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；RT-PCR反應(yīng)試劑盒，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 病料處理 無(wú)菌采集發(fā)病鴨的肝臟和脾臟，剪碎后按1∶3比例加入無(wú)菌PBS溶液，充分研磨制備組織懸液，反復(fù)凍融3次后8 000 r/min離心10 min，取上清液用于病毒核酸的提取，具體提取步驟參考試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)。

1.4.2 病原鑒定 根據(jù)GenBank 中登錄的新型鴨呼腸孤病毒S1基因序列，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)特異性鑒定引物，上游引物為5′-ACCTCAGGATATCGCTGAAACT-3′,下游引物為5′-CTCCATCCCTGCAGCACATGTAAAG-3′。RT-PCR擴(kuò)增體系：2×Mix 12.5 μL，One-step Mix 1.25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，病毒RNA 2 μL，ddH2O 7.25 μL。擴(kuò)增程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 20 s，72 ℃ 8 min，擴(kuò)增結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行觀察，膠回收后連接轉(zhuǎn)化并進(jìn)行測(cè)序分析。

1.4.3 病毒的分離培養(yǎng) 將1.4.1制備的組織懸液經(jīng)0.22 μm濾器過(guò)濾后，接種于7日齡SPF雞胚尿囊腔，接種量為0.2 mL/只，胚體放置于37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察胚體情況，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，收取24～144 h內(nèi)死亡雞胚的尿囊液及胚體，研磨后進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)驗(yàn)證和新型鴨呼腸孤病毒檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)是否具有鴨瘟病毒、坦布蘇病毒、副黏病毒、鴨肝炎病毒、細(xì)小病毒等混合感染。分離毒在雞胚傳代穩(wěn)定后，將收取的病毒液接種于Vero細(xì)胞，觀察該病毒對(duì)Vero細(xì)胞的適應(yīng)性。

1.4.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 為探究該病毒對(duì)雛鴨的致病性，將80只1日齡櫻桃谷鴨平均分成2個(gè)組，攻毒組頸部皮下注射病毒液0.5 mL/只(105.0ELD50/0.1 mL)，對(duì)照組頸部皮下注射同等劑量無(wú)菌PBS溶液，每天觀察鴨只精神狀態(tài)和死亡情況。于攻毒前和攻毒后第10天分別進(jìn)行稱重，比較體重變化情況；同時(shí)于攻毒后第5、7天和第10天進(jìn)行剖檢，每次每組剖檢10只，觀察臟器變化情況；剩余鴨只繼續(xù)飼養(yǎng)至8周，觀察腿病發(fā)生情況。

2 結(jié)果

2.1 病原鑒定 通過(guò)PCR擴(kuò)增得到1 300 bp的特異性條帶(圖1)，與新型鴨呼腸孤病毒S1基因擴(kuò)增片段大小相符。經(jīng)測(cè)序和同源性分析，可知分離病毒株與新型鴨呼腸孤病毒代表毒株(TH11、091等代表毒株)同源性為94%～96%，與北京鴨呼腸孤病毒[4](KT861593)同源性為96.8%，與鵝呼腸孤病毒(Goose orthoreovirus，GRV)同源性為95%，與番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)同源性為49%～50%，與禽呼腸孤病毒(Avian orthoreovirus，ARV)同源性為44%～48%，利用MEGA軟件建立進(jìn)化樹(shù)分析可知，分離病毒株與新型呼腸孤病毒和鵝源呼腸孤病毒親緣關(guān)系較近，與MDRV、ARV處于不同分支(圖2)，因此確定該分離病毒株為新型鴨呼腸孤病毒，毒株命名為HZDRV。

圖1 S1基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of S1 geneM：Marker； 1：陰性對(duì)照； 2：陽(yáng)性對(duì)照； 3：肝臟； 4：脾臟M:Marker; 1:Negative control; 2:Positive control; 3:Liver; 4:Spleen

圖2 不同毒株S1基因序列的同源性分析Fig.2 Homology analysis of S1 gene sequences from different strains▲：本試驗(yàn)分離株▲:The strain isolated in this experiment

2.2 病毒的分離培養(yǎng) 組織懸液接種7日齡SPF雞胚后，可導(dǎo)致胚體在72～96 h內(nèi)集中死亡，胚體呈現(xiàn)水腫、嚴(yán)重出血(圖3)。收取尿囊液和胚體進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，新型鴨呼腸孤病毒擴(kuò)增陽(yáng)性，鴨瘟病毒、坦布蘇病毒、副黏病毒、鴨肝炎病毒、細(xì)小病毒擴(kuò)增陰性(圖4)，細(xì)菌檢測(cè)陰性。病毒液接種Vero細(xì)胞后，細(xì)胞圓縮脫落，傳至第5代時(shí)，觀察到細(xì)胞拉網(wǎng)空泡化(圖5)，因此該病毒在雞胚和Vero細(xì)胞上均可增殖。

圖3 NDRV分離毒株感染雞胚病變Fig.3 Lesion of chick embryo infected with NDRV isolate 1：正常胚體； 2～3：死胚胚體1:Normal embryo body; 2-3:Dead embryo body

圖4 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 RT-PCR detection resultM：Marker； 1：陽(yáng)性對(duì)照； 2：陰性對(duì)照； 3：新型鴨呼腸孤病毒；4：細(xì)小病毒； 5：鴨肝炎病毒； 6：副黏病毒；7：坦布蘇病毒； 8：鴨瘟病毒M:Marker; 1:Positive control; 2:Negative control; 3:Novel duck reovirus; 4:Parvovirus; 5:Duck hepatitis virus; 6:Paramyxovirus; 7:Tambus virus; 8:Duck plague virus

2.3 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 雛鴨致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示：1日齡雛鴨攻毒后第5天死亡1只，剖檢可見(jiàn)脾臟壞死，但尚未形成炎性膜；攻毒后第7天未出現(xiàn)雛鴨死亡，但剖檢時(shí)可見(jiàn)壞死灶和炎性膜。攻毒后第10天仍未出現(xiàn)雛鴨死亡，但剖檢發(fā)現(xiàn)脾臟壞死比例為10/10，對(duì)照組為0/10。稱重結(jié)果顯示，攻毒組平均體重為390 g，對(duì)照組平均體重為538 g，攻毒組體重明顯低于對(duì)照組，兩組相差38%。觀察至第8周，攻毒組有5只出現(xiàn)瘸腿，瘸腿比例5/10，跗關(guān)節(jié)無(wú)明顯變化，剖檢可見(jiàn)膝關(guān)節(jié)及附近的肌肉有大量干酪樣物、部分鴨股骨頭壞死，結(jié)果見(jiàn)圖6；對(duì)照組無(wú)腿病發(fā)生。

圖5 病毒在Vero細(xì)胞上增殖Fig.5 Virus multiplication in Vero cellsA：對(duì)照； B：24 h； C：40 h； D:48 hA:Control; B:24 h; C:40 h; D:48 h

3 討論

本試驗(yàn)從發(fā)生脾臟壞死的病死鴨中分離出病毒株，并用RT-PCR擴(kuò)增、測(cè)序分析確認(rèn)為新型鴨呼腸孤病毒，隨后將分離到的病毒株接種于1日齡櫻桃谷雛鴨，通過(guò)剖檢觀察到脾臟壞死、變硬，還觀察到肝臟有壞死灶，證明新型鴨呼腸孤病毒可導(dǎo)致雛鴨的脾臟和肝臟壞死。據(jù)劉偉等[2]報(bào)道，感染鴨還可觀察到心肌出血、腎臟和法氏囊出血，但在本試驗(yàn)中未觀察到相應(yīng)癥狀，可能是不同分離毒株在致病機(jī)理方面有所差異。攻毒鴨觀察至第8周，50%左右的鴨出現(xiàn)瘸腿癥狀，主要剖檢癥狀為肌腱肌肉處有大量黏液或干酪樣物，與養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)第6～8周出現(xiàn)的腿病癥狀吻合，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室的分離鑒定，在肌腱中分離到NDRV。鴨發(fā)生瘸腿的因素有很多，如鴨呼腸孤病毒、葡萄球菌、鴨沙門菌、鏈球菌感染及外傷等。葡萄球菌感染多發(fā)生在中鴨和成鴨，引起跗關(guān)節(jié)和趾關(guān)節(jié)腫脹變形，剖檢觀察到關(guān)節(jié)腔內(nèi)有白色或淡黃色膿性分泌物或干酪樣物，肌腱也腫脹變形?；\舍的金屬尖銳處或地面的突出粗糙會(huì)造成鴨的外部傷口，若飼養(yǎng)環(huán)境處理不當(dāng)，會(huì)繼而引發(fā)細(xì)菌感染，嚴(yán)重者會(huì)引起瘸腿。所以對(duì)于腿部疾病病例，需要臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)相結(jié)合的方式進(jìn)行鑒別診斷。目前，我國(guó)尚未研發(fā)出新型鴨呼腸孤病毒疫苗，根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)情況，疫苗研制更加迫切，特別是活疫苗的研制和開(kāi)發(fā)[10-11]，會(huì)給前期腿病防控帶來(lái)新曙光。雛鴨脾臟壞死的防控可側(cè)重母源抗體的保護(hù)，目前母源抗體或卵黃抗體對(duì)雛鴨的保護(hù)尚不明確，需要進(jìn)一步研究。