程 延，趙朝偉，李 浩，楊謝安，魏 兵，王彥鵬，全 健，竇群立，昝 強

(1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003；2.洛南縣中醫(yī)醫(yī)院，陜西 洛南 726100；3.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712021)

急性軟組織損傷是骨科常見病、多發(fā)病，中醫(yī)屬“筋傷”范疇，可單獨出現(xiàn)，也可同時伴有骨折，損傷后的腫痛和肢體活動受限，給患者造成很大痛苦，甚至導致不同程度的殘疾而嚴重影響患者身體健康和生活質(zhì)量，對其治療的研究日益受到重視。在暴力作用下，機體皮膚、肌肉、肌腱、筋膜、韌帶等軟組織受到撞擊、扭轉(zhuǎn)、牽拉等作用后，隨即出現(xiàn)急性無菌性炎癥改變，伴隨免疫功能降低或紊亂。資料表明，中醫(yī)藥對于損傷的軟組織有較好的治療作用和免疫調(diào)節(jié)作用。中藥具有資源豐富、用藥成本低、藥力持久、低或無副反應等優(yōu)點，研制具有免疫調(diào)節(jié)作用的中藥制劑是新藥開發(fā)的重要內(nèi)容[1]。玄黃藥膏是我院用于治療“氣滯血瘀型”急性筋傷(急性軟組織損傷)的經(jīng)驗方，臨床實踐證明，該藥療效顯著，安全、未出現(xiàn)毒副作用及過敏反應，取得較好的臨床效果[2-4]。動物實驗證明[5-6]，玄黃藥膏可以降低損傷局部組織中如白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)等多種炎癥因子含量而發(fā)揮較好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。本研究在以往研究的基礎(chǔ)上，通過動物實驗探討玄黃藥膏對急性軟組織損傷大鼠免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SD大鼠90只，雌雄各半，體重237～401 g，平均313.33 g，購自西安交通大學實驗動物中心，動物資格證號：SCXK(陜)2017-003。實驗在陜西中醫(yī)藥大學動物實驗室進行，動物室室溫19～24 ℃，相對濕度約40%。實驗前選用標準大鼠飼料適應性喂養(yǎng)3 d，自由清潔飲水，每兩天清潔籠具1次。

1.1.2 主要試劑和儀器：玄黃藥膏：由酒大黃15 g，梔子30 g，蒲公英9 g，乳香、沒藥各8 g，蟲3 g組成。購自陜西省中醫(yī)醫(yī)院中藥房，藥監(jiān)合格，藥物按比例粉碎，用100目篩子篩為細末備用。樣品藥制備：用凡士林為基質(zhì)與藥粉以質(zhì)量比為1∶1的比例制成所需藥膏。扶他林軟膏(北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字H19990291)。無水乙醇、中性樹膠、7%硫化鈉溶液、10%水合氯醛溶液等由西安恩斯維爾生物公司提供，姬姆薩復合染液、蘇木精染液、液體石蠟、伊紅染液、甲醛溶液等由北京索萊寶公司提供。燒杯、采血管、刻度試管、高精度加樣器、離心管、移液槍、包埋盒、切片刀頭、一次性吸管等由西安恩斯維爾生物公司提供，分光光度計、天平、水浴鍋、恒溫箱、包埋機、切片機、高速冷凍離心機等由陜西中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，局部打擊器。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模、分組與給藥：將動物隨機分為實驗組、對照組和空白組三組，每組30只。術(shù)前脫毛處理：實驗前1天用8%硫化鈉涂抹于大鼠左側(cè)大腿中部。造模方法[7]：將大鼠麻醉后，選擇左側(cè)后肢大腿中部外側(cè)肌肉豐隆處，使用100 g砝碼、從垂直高度50 cm處，自由落體落下，準確打擊，反復進行3次，造成皮下瘀斑、腫脹的閉合性軟組織損傷模型，且無骨折和開發(fā)性破損。造模成功30 min后開始給藥，實驗組、對照組和空白組分別予玄黃藥膏和扶他林、凡士林各3 g外敷，醫(yī)用紗布覆蓋創(chuàng)面，膠布固定。每24 h換藥1次。連續(xù)治療7 d后測量各指標。

1.2.2 淋巴細胞轉(zhuǎn)化率檢測：取大鼠尾部靜脈血1滴，置于玻片的一端，另取邊緣光滑平整的玻片作推片，使血滴成片狀，推成血膜(頭、體、尾分明)干燥，等其干燥后用姬薩姆染液染色3～7 min，再用生理鹽水沖洗，濾紙干燥后使用油鏡觀察。計算淋巴細胞轉(zhuǎn)化率：觀察每張玻片的頭、體、尾三段。每段各一縱列(目的是減少誤差)，每張玻片計數(shù)200～400個細胞，計算轉(zhuǎn)化率，其中頭部50～100個，體部50～100個，尾部100～200個。一般認為轉(zhuǎn)化率的正常值為60%～70%。計算公式：淋巴細胞轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化淋巴細胞/(轉(zhuǎn)化淋巴細胞+未轉(zhuǎn)化淋巴細胞)×100%。

1.2.3 巨噬細胞吞噬百分率及吞噬指數(shù)：治療第4 天(即正式采集標本前72 h)將5%可溶性淀粉酶注射入各組大鼠腹腔中作為誘導劑使大鼠產(chǎn)生腹腔巨噬細胞。實驗前1 h向大鼠腹腔注射5%雞紅細胞懸液(具有清晰細胞核)0.6 ml，全部注射后輕柔大鼠腹部2 min。水合氯醛鎮(zhèn)定麻醉下在大鼠腹部中央使用剪子剪開皮膚一小口，暴露腹膜，是用鑷子提起腹膜剪一小口，使用無菌吸管吸取腹腔液，滴入玻片中，使用另一張潔凈玻片推片，置入37 ℃溫箱中孵育30 min。取出涂片，生理鹽水輕輕沖洗表面，待自然干燥后使用姬姆薩懷特(Giemsa-Wright)染液染色，3 min后再用生理鹽水輕輕沖洗，濾紙濾干水分，使用丙酮-甲醇溶液進行固定，并蓋上蓋玻片。放入油鏡下觀察200個巨噬細胞吞噬雞紅細胞數(shù)，并計算吞噬百分率及吞噬指數(shù)[8]。計算公式：吞噬百分率=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/200個巨噬細胞×100%，吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細胞總數(shù)/吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)。

1.2.4 補體活性檢測：每組大鼠心臟取血、靜置。第1步：制備50%溶血標準管，取2%綿羊紅細胞懸液2 ml加入蒸餾水8 ml，待細胞完全溶解后為100%全溶血管。取全溶血管上清液2.5 ml并加入巴比妥緩沖液2.5 ml，1∶1混勻后，即為50%溶血標準管。第2步：制備大鼠血清，將大鼠水合氯醛鎮(zhèn)定麻醉后，心臟取血，將血液分別放入無菌試管中4 ℃冰箱靜置保存，待血液分層后用無菌吸管將大鼠血清吸出放入無菌錐瓶混勻，再使用無菌刻度吸管每次吸入1 ml血清放入小離心管內(nèi)蓋好并-60 ℃保存。第3步：測算血清補體活性，實驗前取1只大鼠血清于室內(nèi)融化，后取大鼠血清0.2 ml與巴比妥緩沖液3.8 ml進行1∶20稀釋，取10支試管，順序編號后按表1所示將各試劑加入、混勻，其中抗綿羊紅細胞溶血素按效價稀釋至1∶2000，置于37 ℃水浴箱中30 min后拿出，將各反應管以2500 r/min離心5 min，先目測觀察各管并與50%溶血標準管比較，選擇溶血度與標準管最接近的兩管，用分光光度計于波長542 nm處進行比色。巴比妥緩沖液為空白矯正零點，按透光率百分比比測找出最接近標準管的一管，根據(jù)該管血清使用量，測算補體活性[9]。計算公式：補體活性(U/ml)=1/血清用量(ml)×血清稀釋倍數(shù)。

1.2.5 脾重及脾指數(shù)：大鼠稱量體重后，處死開腹，摘除脾臟，濾紙吸干殘留血液及腹腔液，分析天平稱重。計算公式如下：脾指數(shù)[10]=脾臟重量(mg)/體重(g)。

1.2.6 組織病理學觀察：取各組大鼠肌纖維，行HE染色，鏡下觀察各組大鼠肌細胞情況。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化率、吞噬百分率和吞噬指數(shù)比較 治療7 d后，與空白組相比，實驗組與對照組大鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化率、吞噬百分率和吞噬指數(shù)均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化率、吞噬百分率和吞噬指數(shù)比較

2.2 各組大鼠補體活性、脾重和脾指數(shù)比較 治療7 d后，實驗組和對照組大鼠補體活性以及脾重、脾指數(shù)與空白組相比均增強或升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；實驗組與對照組大鼠補體活性、脾重和脾指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠補體活性、脾重和脾指數(shù)比較

2.3 各組肌纖維組織病理學改變 空白組肌纖維排列規(guī)則，分界清晰，細胞形態(tài)正常，染色均勻，未見明顯異常；對照組肌纖維排列規(guī)則，分界清晰，細胞形態(tài)正常，染色均勻，局部出血，間質(zhì)可見少量炎細胞浸潤；實驗組肌纖維排列規(guī)則，分界清晰，間質(zhì)可見少量炎細胞浸潤，局部可見出血(圖1)。

圖1 三組大鼠肌纖維組織病理圖片(HE染色，×200)

3 討 論

機體受到外傷時免疫系統(tǒng)迅速作出反應，隨后發(fā)生一過性的改變，這種改變可歸類為“促炎”和“抑制炎癥”反應。正常機體有一種精細的調(diào)節(jié)功能，將免疫應答控制在適當范圍內(nèi)。一旦這種調(diào)節(jié)作用受損或喪失，會對機體造成損傷。人為的進行干預，使機體避免產(chǎn)生異常的免疫應答，或使已出現(xiàn)的異常免疫應答得以逆轉(zhuǎn)，是現(xiàn)代多種疾病免疫治療形成和發(fā)展的基礎(chǔ)[11]。目前，西藥免疫治療藥物如補體活性抑制劑依庫麗單抗等廣泛應用于臨床，雖有療效，但治療局限，毒副作用大[12]。中藥及方劑大多屬天然動植物，藥理應用體系多樣，且耐藥性低、不良反應少。因此，探尋更加安全、有效的具有免疫治療作用的中藥有著重要的意義。我國學者為此做了大量研究。曹錦花[13]研究發(fā)現(xiàn)，茵陳、黃芩等組成的方劑具有清熱解毒、利膽退黃、調(diào)節(jié)免疫作用?？婎l等[14]應用中藥方(由茵陳、青蒿、黃芩等組成)治療新生兒ABO血型產(chǎn)前溶血，提示該方可降低血清膽紅素水平，提高免疫功能，有效率達95.00%。田昕[1]研究發(fā)現(xiàn)，外用乙乙膏(桑寄生、雞血藤、大黃等)可調(diào)節(jié)急性軟組織損傷大鼠體液免疫和細胞免疫狀態(tài)，增強機體對免疫器官的保護和恢復作用。研究表明，杜仲、木香、金銀花具有良好的抗補體活性作用，研究和發(fā)掘抗補體活性的中藥必將為臨床提供多樣化的治療方式[15]。本方中大黃、蟲有破瘀通經(jīng)、消腫止痛的作用，乳香、沒藥活血行氣，梔子、蒲公英清熱舒筋，共同協(xié)助大黃化瘀泄熱。本實驗進一步探討其對損傷機體免疫功能的影響。

機體受抗原刺激后，淋巴細胞發(fā)生變化，向淋巴母細胞轉(zhuǎn)化，釋放淋巴因子等一系列免疫物質(zhì)，促進損傷修復。巨噬細胞是機體免疫應答的重要效應和調(diào)節(jié)細胞，參與天然免疫，并在獲得性免疫應答中起協(xié)同作用，具有分泌多種細胞因子，捕捉、吞噬、溶解病原體，參與抗原遞呈等作用[11]。機體的非特異性免疫功能一定程度上由巨噬細胞吞噬活性大小反應完成[16]。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率、巨噬細胞吞噬率變化可反映細胞免疫的狀態(tài)和機體損傷的恢復能力[1]。本實驗顯示，經(jīng)玄黃藥膏和扶他林治療的大鼠，腹腔巨噬細胞吞噬率、吞噬指數(shù)和淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率均有不同程度的增加，與空白組比較有統(tǒng)計學差異，說明本方能夠提高大鼠巨噬細胞的吞噬率和淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，對體內(nèi)的免疫功能有促進作用。

補體是具有酶活性的蛋白質(zhì)，存在于人和脊椎動物血清和組織液中，其正?；罨欣谠鰪娒庖吡?，但過度激活可引起組織損傷等[17-19]。補體能使溶血素(抗綿羊紅細胞抗體)致敏的綿羊紅細胞發(fā)生溶血，綿羊紅細胞濃度恒定時補體活性與溶血程度呈正比。因此，可通過溶血程度來判斷血清中的補體含量，反映其對機體體液免疫功能的影響[1]。免疫器官(如胸腺、脾臟)重量變化在一定程度上反映了機體的免疫功能。李覃等[20]研究表明，中藥青蒿素能明顯降低遲發(fā)型超敏反應模型小鼠免疫器官的臟器(胸腺、脾)指數(shù)，顯示出一定的免疫抑制效應。本實驗中，玄黃藥膏與空白組相比大鼠補體活性增強，脾重和脾指數(shù)升高，提示玄黃藥膏有利于促進大鼠體液免疫功能，對免疫器官功能有保護作用，與上述研究結(jié)論一致。

綜上所述，本實驗結(jié)果顯示，玄黃藥膏可使急性軟組織損傷大鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化率提高、腹腔巨噬細胞吞噬功能和補體活性增強、脾重量和脾指數(shù)增加，提示玄黃藥膏治療急性軟組織損傷可能與抗炎作用和增強機體的免疫力有關(guān)。但值得提出的是，因為正常個體免疫系統(tǒng)有一定的代償能力，免疫應答機制會得到恢復乃至增強以提高自身的抗病能力，恢復速度及程度取決于創(chuàng)傷的嚴重程度和持續(xù)時間，而且，重度創(chuàng)傷(如嚴重軟組織傷)對免疫功能有明顯的抑制作用，輕度創(chuàng)傷則有增強作用[21-23]。本實驗動物模型建立在相對“輕的軟組織損傷”基礎(chǔ)上，治療中未出現(xiàn)因免疫反應增強而發(fā)生的組織損傷，說明玄黃藥膏協(xié)同增強免疫功能而發(fā)揮了積極作用。所以，本實驗未能回答玄黃藥膏對促進免疫功能是否最優(yōu)化及最優(yōu)化的使用量、是否對嚴重的軟組織傷的免疫抑制有效等問題，值得進一步研究。