楊云霜，趙 雪，杜 磊，李延暉，石鵬展 ，SABUR Sanzhar(哈薩克斯坦)，張 蓉

(1.北京市隆福醫(yī)院治未病科，北京 100010；2.火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心，北京 100088；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

輻射極易造成免疫系統(tǒng)的損害，抑制保護(hù)性免疫因子的生成以及釋放大量?jī)?nèi)源性危害因子，這些免疫系統(tǒng)的改變均能造成機(jī)體免疫功能障礙并伴隨組織損傷，故輻射損傷中免疫系統(tǒng)防護(hù)為當(dāng)今亟待解決的輻射防護(hù)問題之一。Ito等[1]對(duì)1945年廣島原子彈爆炸暴露人群追蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)此類人群均有不同程度胸腺萎縮。同時(shí)有研究顯示輻射可引起血液、脾臟、淋巴中免疫細(xì)胞數(shù)目減少[2]。這與本研究小組前期對(duì)胸腺、脾臟指數(shù)觀察所得結(jié)果一致[3]。文獻(xiàn)表明輻射主要通過TLR4信號(hào)通路介導(dǎo)相關(guān)炎癥反應(yīng)，故此通路相關(guān)受體與蛋白的表達(dá)在機(jī)體遭受輻射后常存在不同程度的改變[4]，但對(duì)此通路上下游相關(guān)因子與輻射相關(guān)性的系統(tǒng)闡述尚未可知。本研究中補(bǔ)腎解毒方為滋陰補(bǔ)腎、清熱解毒之方，有扶正祛邪之效，通過長(zhǎng)期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其能夠調(diào)節(jié)輻射后炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[5-6]，本研究通過測(cè)定輻射后第1、14、30 天TLR4通路上下游因子水平的變化，以探索補(bǔ)腎解毒方抗輻射后免疫損傷防護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 研究動(dòng)物：SPF級(jí)健康雄性小鼠276只，平均體重(20±2) g，由南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(蘇)2010-0001。其中138只為直接從南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院購(gòu)買C57BL/10SCNJ(TLR4-/-)基因敲除小鼠，另外138只小鼠為南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所從美國(guó)JAX公司代購(gòu)的C57BL/10SCNJ(TLR4+/+)小鼠繁育的子代。小鼠自由攝食飲水，進(jìn)食普通顆粒飼料，北京師范大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房飼養(yǎng)，動(dòng)物房保持恒溫，22 ℃，濕度60%～90%。

1.1.2 主要試劑與儀器：小鼠TOLL樣受體4酶聯(lián)免疫試劑盒(RGB & CHN公司，Lot:20150109、60293M)，CD14/Treg細(xì)胞流式試劑盒(BD PMG公司)。電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司，型號(hào)：00000246)、60Coγ射線輻射裝置(北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院)、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(上海天美科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：CT15RT)、Thermo 全自動(dòng)酶標(biāo)儀(芬蘭Thermo Scientific公司，型號(hào)：Multiskan MK3)、流式細(xì)胞儀(德國(guó) BD Calibur公司，型號(hào)：雙激光四色)、流式細(xì)胞分析軟件(德國(guó) BD Calibur公司，版本：CellQuest Pro)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 補(bǔ)腎解毒方：由熟地、山藥、牡丹皮、茯苓、澤瀉、白花蛇舌草各10 g，山茱萸12 g，冬蟲夏草3 g組成本方。

1.2.2 建模分組及給藥：采用隨機(jī)數(shù)字表法將138只TLR4+/+小鼠隨機(jī)分為TLR4+/+空白對(duì)照組18只、TLR4+/+輻射模型組60只、TLR4+/+補(bǔ)腎解毒方組60只；138只TLR4-/-小鼠隨機(jī)分為TLR4-/-空白對(duì)照組18只、TLR4-/-輻射模型組60只、TLR4-/-補(bǔ)腎解毒方組60只。按人體給藥量換算成小鼠等效劑量作為小鼠給藥量，給藥劑量為13.5 g/(kg·d)[7]，將中藥顆粒加無(wú)菌水配至18 ml混合液，現(xiàn)配現(xiàn)用，給藥劑量為0.2 ml/d。分組后每天上午8:00補(bǔ)腎解毒方組給予中藥灌胃，容積0.2 ml，空白對(duì)照組、輻射模型組給予生理鹽水灌胃，容積0.2 ml，連續(xù)灌胃10 d，第11 天，除空白對(duì)照組外，其他四組分別進(jìn)行一次性6Gy60Co γ-射線照射，照射后第1 天開始繼續(xù)灌胃，連續(xù)30 d。

TLR4+/+空白對(duì)照組、TLR4-/-空白對(duì)照組分別于輻射后第1、14、30天各取材6只。其余四組分別于輻射后第1天取材7只；輻射后第14天取材每組存活小鼠數(shù)量的50%；輻射后第30天每組剩余存活小鼠全部取材。眼球采血后頸椎脫臼法處死；采血(1±0.2)ml，放入1.5 ml含有肝素抗凝劑的離心管中，置4 ℃，離心半徑8 cm離心機(jī)，3000 r/min，離心5 min，分離血清，置-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 ELISA檢測(cè)法：將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后加樣，置37 ℃溫育30 min，20 ml的30×PBS緩沖液、580 ml純水配制成600 ml、pH值為7.4的洗液，孵育完成后撤掉封板膜，棄液后甩干，加洗滌液靜置30 s后棄去，重復(fù)5次，加酶50 μl，再次溫育、洗滌，加顯色劑A、B顯色，37 ℃避光顯色15 min后加終止液50 μl，依序測(cè)量各孔吸光度，讀取數(shù)值。

1.2.4 流式細(xì)胞學(xué)法：加入抗體，分別加入CD14、CD4、CD25抗體各5 μl，加樣本100 μl，充分搖勻，室溫避光孵育20 min。取出試管，每管加溶血素2 ml，室溫避光放置10 min。待紅細(xì)胞全部溶解，1500 r/min，離心5 min，去上清。每管加入2 ml的PBS緩沖液洗細(xì)胞兩次，1500 r/min，離心5 min，去上清，每管加入0.5 ml的PBS，放4 ℃冰箱，4 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 輻射后各組小鼠CD14的動(dòng)態(tài)變化 輻射后第1天，各輻射模型組小鼠CD14與空白對(duì)照組相比均有不同程度的降低(P<0.01)，且TLR4+/+補(bǔ)腎解毒方組與TLR4+/+輻射模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TLR4-/-補(bǔ)腎解毒方的CD14與TLR4-/-輻射模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。輻射后第14天，各輻射模型組CD14明顯升高，且均高于空白對(duì)照組水平(P<0.01)。TLR4+/+補(bǔ)腎解毒方組的CD14高于TLR4+/+輻射模型組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。TLR4-/-補(bǔ)腎解毒方組的CD14與TLR4-/-輻射模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。輻射后第30天，各輻射組CD14水平與第14天比較均有所下降，但TLR4+/+補(bǔ)腎解毒方組仍高于TLR4+/+輻射模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。TLR4-/-補(bǔ)腎解毒方組的CD14與TLR4-/-輻射模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1(圖1)。

表1 各組小鼠輻射后CD14水平比較(%)

2.2 輻射后各組小鼠TLR4動(dòng)態(tài)變化 輻射后第1天，各輻射組TLR4無(wú)明顯變化；輻射后第14天及第30天TLR4+/+補(bǔ)腎解毒方組的TLR4均高于TLR4+/+輻射模型組，且輻射后第30天，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3 輻射后各組小鼠MD2動(dòng)態(tài)變化 輻射后第1天，各輻射模型組MD2無(wú)明顯變化；輻射后第14天及第30天，TLR4+/+補(bǔ)腎解毒方組的MD2高于TLR4+/+輻射模型組；輻射后第1天TLR4-/-補(bǔ)腎解毒方組與TLR4-/-輻射模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各時(shí)間點(diǎn)的MD2水平TLR4-/-補(bǔ)腎解毒方組、TLR4-/-輻射模型組與TLR4-/-空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表3。

2.4 輻射后各組小鼠CD4+CD25+Treg細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化 輻射后第1天，與空白對(duì)照組比較，TLR4-/-輻射模型組CD4+CD25+Treg細(xì)胞均低；其他三組均高于空白對(duì)照組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TLR4+/+補(bǔ)腎解毒方組低于TLR4+/+輻射模型組，輻射后第14天及第30天，各輻射模型組CD4+CD25+Treg細(xì)胞與空白對(duì)照組比較均升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TLR4+/+補(bǔ)腎解毒方組的CD4+CD25+Treg細(xì)胞高于TLR4+/+輻射模型組，TLR4-/-補(bǔ)腎解毒方組與TLR4-/-輻射模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表4(圖2)。

圖1 各組小鼠輻射后各時(shí)間點(diǎn)CD14動(dòng)態(tài)變化

圖2 各組小鼠輻射后各時(shí)間點(diǎn)Treg細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化

表2 各組小鼠輻射后TLR4動(dòng)態(tài)變化(ng/ml)

表3 各組小鼠輻射后MD2動(dòng)態(tài)變化(ng/ml)

表4 各組小鼠輻射后Treg細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化(%)

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為輻射是一種由外作用于人體，具有強(qiáng)烈致病作用的毒邪，來(lái)勢(shì)剽悍、易傷陰耗氣、損傷各臟腑功能、損傷正氣，進(jìn)而導(dǎo)致人體抗病能力下降[8]。通過對(duì)氣血雙補(bǔ)方劑、扶正解毒方劑與滋補(bǔ)腎陰方劑的對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用滋補(bǔ)腎陰方劑可顯著緩解輻射對(duì)免疫器官(胸腺、脾臟)的影響[9]。滋補(bǔ)腎陰方劑不僅可填精益髓，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力，亦可壯水之主，以制陽(yáng)光，緩解由輻射火毒之邪導(dǎo)致的火毒熾盛的表現(xiàn)，如口燥咽干、血熱出血、瘡瘍腫毒等癥[10]。補(bǔ)腎解毒方是以六味地黃丸為基礎(chǔ)，減少熟地用量以防滋膩，另加冬蟲夏草、白花蛇舌草化裁而成，冬蟲夏草能抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能，白花蛇舌草可以刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，提高白細(xì)胞吞噬能力，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力。諸藥合用，具有滋陰益腎、涼血解毒的功效，發(fā)揮保護(hù)機(jī)體、減輕輻射損傷的作用，并且中藥方劑安全性較高、防治結(jié)合，作為輻射防護(hù)藥物易被接受。

TLR4分布廣泛，其相關(guān)通路具有識(shí)別病原體及其產(chǎn)物、釋放炎性因子，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用。TLR4是介導(dǎo)內(nèi)毒素/脂多糖所誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要受體，且與輻射損傷密切相關(guān)，通過激活TLR4通路可以有效產(chǎn)生輻射抵抗現(xiàn)象[11]。TLR4受體的結(jié)構(gòu)分為胞外域、跨膜域、胞內(nèi)域，其中胞外域?yàn)榻Y(jié)合CD14與MD2的重復(fù)亮氨酸序列(Leucine richrepeat，LRR)，具有識(shí)別病原體的作用；胞內(nèi)域的高度保守序列在TLR4與配體結(jié)合后，介導(dǎo)激活相關(guān)炎癥細(xì)胞因子基因的表達(dá)[12]，CD14、TLR4、MD2共同形成跨膜復(fù)合物，在介導(dǎo)內(nèi)毒素引起的炎癥反應(yīng)中起到重要作用。CD4+CD25+Treg細(xì)胞為TLR4信號(hào)通路中一種調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，主要介導(dǎo)免疫耐受，抑制T細(xì)胞免疫功能，下調(diào)免疫應(yīng)答[13]。本此研究旨在通過檢測(cè)外周血中CD14、TLR4、MD2、Treg細(xì)胞水平動(dòng)態(tài)變化，探討輻射對(duì)免疫系統(tǒng)TLR4信號(hào)通路影響和制約，以及補(bǔ)腎解毒方抗輻射損傷是否通過本信號(hào)通路發(fā)揮作用。

CD14在胞外與TLR4受體結(jié)合，可識(shí)別病原體LPS，并將其固定于胞外，具有結(jié)合、富集、遞呈LPS給下游信號(hào)受體的作用[12]。CD14是TLR4上游啟動(dòng)因子，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TLR4+/+小鼠輻射后CD14水平先降低后升高，說明CD14在輻射急性期受到抑制，而輻射后第14 天，補(bǔ)腎解毒方通過刺激CD14大量釋放從而激活TLR4信號(hào)通路，積極對(duì)輻射所致的免疫抑制做出調(diào)整與恢復(fù)，有研究顯示通過TLR4通路的激活，下游釋放出具有保護(hù)作用的炎性因子IL-6、IL-10等[14]。輻射后第30天，TLR4+/+補(bǔ)腎解毒方組的CD14下降更為明顯，接近空白對(duì)照組水平。TLR4-/-小鼠輻射組與補(bǔ)腎解毒方組CD14變化水平與趨勢(shì)基本一致，說明補(bǔ)腎解毒方對(duì)其并未產(chǎn)生保護(hù)作用，CD14水平的波動(dòng)多由機(jī)體受到輻射刺激產(chǎn)生的無(wú)區(qū)別應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致，由此可以推斷，補(bǔ)腎解毒方是通過TLR4信號(hào)通路發(fā)揮免疫防護(hù)作用。

TLR4受體水平輻射后波動(dòng)較小，僅于輻射后第30天出現(xiàn)顯著升高，說明補(bǔ)腎解毒方對(duì)TLR4受體具有遠(yuǎn)期防護(hù)作用。MD2存在于免疫細(xì)胞表面，與TLR4受體形成一種異質(zhì)二聚體復(fù)合物，協(xié)同CD14共同介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)炎性因子[15-16]。本實(shí)驗(yàn)中各組MD2水平區(qū)別不明顯。以上研究結(jié)果顯示TLR4+/+補(bǔ)腎解毒方組小鼠CD14、TLR4、MD2水平變化趨勢(shì)大致一致，均在輻射后第14 天上升，隨后逐漸下降，說明補(bǔ)腎解毒方通過激活TLR4通路，釋放保護(hù)性炎癥因子，包括IL-10、IL-12、TGF-β1等[5-6]，進(jìn)而發(fā)揮免疫防護(hù)效應(yīng)，楊麗梅等[17]認(rèn)為IL-12具有抗輻射損傷效應(yīng)；而TLR4-/-兩組小鼠因體內(nèi)缺乏TLR4受體，因此不能通過TLR4信號(hào)通路進(jìn)行干預(yù)和調(diào)控，輻射后第14天及第30天 CD14、MD2表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組，且兩組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。并且通過測(cè)定下游炎性因子[5]，發(fā)現(xiàn)TLR4-/-小鼠釋放的IL-17，IL-18，IFN-γ等損傷性炎性因子增加，而保護(hù)性炎癥因子IL-10，TGF-β1減少，故出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫損傷及較高的病死率。

CD4+CD25+Treg細(xì)胞作為一種能夠抑制免疫功能的T細(xì)胞亞群，當(dāng)機(jī)體受到輻射時(shí)，能夠維持機(jī)體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，提高機(jī)體的自身修護(hù)能力，以減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，降低輻射后損傷發(fā)生[18-19]。本研究結(jié)果顯示，輻射模型組與TLR4+/+補(bǔ)腎解毒方組CD4+CD25+Treg細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度增高，但補(bǔ)腎解毒方組Treg細(xì)胞表達(dá)水平增加更加平穩(wěn)與長(zhǎng)效。由此可見,補(bǔ)腎解毒方可通過TLR4信號(hào)通路促進(jìn)輻射后機(jī)體內(nèi)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的分化、發(fā)育、成熟，發(fā)揮免疫抑制作用，防止機(jī)體受外界刺激后免疫機(jī)能亢進(jìn)，從而保護(hù)機(jī)體免受輻射傷害。

所述，輻射所致機(jī)體免疫功能障礙通過作用于TLR4信號(hào)通路形成，而本研究團(tuán)隊(duì)的補(bǔ)腎解毒方具有滋陰益腎、涼血解毒功效，可通過對(duì)此通路的調(diào)節(jié)起到減少損傷性炎癥因子釋放，增強(qiáng)機(jī)體正常免疫功能，從而減輕輻射所致免疫功能障礙，為涉核人員、接受放射療法癌癥患者預(yù)防性用藥及核接觸后防護(hù)性用藥。