盧霞　劉夢華　鄧志軍　孫秋月　夏迎春　李文虎　司龍亭　阿門

摘要：為明確黃瓜（CucumissativusL.）自交系間的親緣關系，篩選適宜作為雜交親本的種質(zhì)資源，利用InDel標記對48份黃瓜自交系進行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，68對InDel標記中39對標記具有強多態(tài)性，在48份材料中共檢測出79個等位基因，平均每對標記檢測到2.0256個等位基因，遺傳距離在0～0.9551范圍之間，相似性系數(shù)在0.44～1.00之間，平均相似性系數(shù)為0.72，說明48份材料總體親緣關系較近，遺傳多樣性不夠豐富。NTSYS2.1軟件聚類結(jié)果表明，在相似性系數(shù)為0.44時，48份材料被劃分為兩大類群，主要為密刺黃瓜和水果黃瓜，用PowerMarker3.25軟件進行樹狀圖分析，分析結(jié)果與NTYSYS聚類結(jié)果一致。研究結(jié)果可為了解黃瓜種質(zhì)資源遺傳背景及親本組合的選配奠定基礎。

關鍵詞：黃瓜種質(zhì)資源;InDel標記;遺傳多樣性分析;多態(tài)性分析;聚類分析

中圖分類號：S642.202文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）01-0049-05

作者簡介：盧霞（1991—），女，甘肅天水人，碩士，助理研究員，主要從事分子標記輔助育種與種子純度鑒定。E-mail：1344963751@qq.com。

通信作者：阿門，博士，副研究員，主要從事作物遺傳育種研究。E-mail：2582259972@qq.com。

黃瓜（CucumissativusL.，2n=14）是葫蘆科甜瓜屬一年生蔓生植物，是一種世界性栽培蔬菜。黃瓜在我國已有2000多年的栽培歷史，已成為我國主要栽培蔬菜之一[1]。經(jīng)過長時間的自然和人工選擇，黃瓜材料間的遺傳背景極其相似，栽培黃瓜品種的遺傳變異顯著減少，品種間的遺傳多樣性遠低于同屬的甜瓜[2-5]，使黃瓜的形態(tài)鑒定容易受到環(huán)境因素的影響。因此，明確育種材料的遺傳多樣性和親緣關系已成為黃瓜育種的重要工作之一。

傳統(tǒng)育種方法很難滿足黃瓜遺傳改良發(fā)展的需求，目前，分子標記是進行黃瓜種質(zhì)遺傳多樣性及親緣關系分析的有效工具。近年來，為了更好地鑒別黃瓜，各種基于DNA的分子標記被開發(fā)出來。限制性內(nèi)切酶片斷長度多態(tài)性（RFLP）、擴增片斷長度多態(tài)性（AFLP）、簡單重復序列標記（SSR）、表達序列標簽-簡單重復序列標記（EST-SSR）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）等現(xiàn)代分子標記技術已在黃瓜遺傳育種中得到應用。Dijkhuizen等利用RFLP分子標記方法對16個黃瓜品種進行遺傳多樣性分析并將聚類結(jié)果與同工酶標記聚類結(jié)果進行對比，結(jié)果表明RFLP分子標記聚類結(jié)果與同工酶標記聚類結(jié)果一致[6]。李錫香等通過AFLP分子標記對70多份黃瓜材料進行遺傳多樣性研究，將70份材料聚類為西雙版納黃瓜、野生黃瓜和栽培黃瓜三大類群[7]。穆生奇等利用SSR分子標記技術對59份黃瓜材料進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明59份黃瓜材料被劃分到7個類群當中[8]。劉俊青等用EST-SSR標記評價了21份不同生態(tài)類型黃瓜種質(zhì)的遺傳多樣性，21份黃瓜種質(zhì)可分為兩大類群[9]。姚丹青等利用42個SNP位點進行黃瓜遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，42個SNP位點中有30個位點的多態(tài)信息量為0.027～0.528，71個黃瓜品種兩兩間的遺傳相似系數(shù)分布在0.4032～0.9809之間[10]。

基于全基因組重測序開發(fā)的插入/缺失[Insertion/Deletion（InDel）]標記是指2個親本間在全基因組序列中的差異。InDel標記因其具有在基因組內(nèi)分布廣、密度高、變異穩(wěn)定、多態(tài)性強、檢測容易等優(yōu)點[11-12]，受到越來越多的關注，在生物遺傳多樣性、品種純度鑒定、親緣關系鑒定以及分子育種上都有重要的應用價值[12-16]。本研究利用江蘇綠港現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司（江蘇綠港）育種研究所提供的48份黃瓜自交系，采用基于綠美1號父母本全基因組重測序開發(fā)的InDel標記，鑒定了黃瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關系，旨在為黃瓜種質(zhì)資源收集和保存提供參考，指導在育種中合理選擇選配親本，從而減少育種的盲目性加快育種進程。

1材料與方法

1.1材料

供試材料選自江蘇綠港現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司（江蘇綠港）育種研究所提供的48份黃瓜自交系（表1），代號為D1～D23、X1～X18、B1～B7。

1.2方法

1.2.1黃瓜基因組DNA的提取

2020年3月6日將供試材料播種于江蘇綠港育苗棚中，待長至2～3張真葉時取樣，用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取黃瓜基因組DNA。具體提取步驟如下：（1）取新鮮葉片30mg放入2mL的離心管中，加入1個直徑4mm的鋼珠，蓋緊蓋子，將其放入液氮中60s，然后利用組織研磨儀磨樣80s;（2）磨好樣后，加入600μLCTAB提取液，55℃水浴15min，每隔5min上下翻轉(zhuǎn)混勻1次;（3）12000r/min離心5min，吸取400μL上清于干凈的1.5mL離心管中，加入250μL三氯甲烷和異戊醇混合物（24三氯甲烷∶[KG-*3]1異戊醇），充分混勻;（4）13000r/min離心90s，取300μL上清于另一個新的1.5mL離心管中，加入在-20℃條件下提前預冷的無水乙醇600μL，混勻，-20℃冰箱放置1h;（5）12000r/min離心5min，倒掉上清液，室溫放置;（6）待離心管中無乙醇味時，加入100μLddH2O溶解DNA。分別用超微量紫外可見分光光度計（DeNovixDS-11）和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的濃度和質(zhì)量，放-20℃冰箱存放備用。

1.2.2PCR擴增與檢測

PCR反應體系為25μL，其中12.5μL2×TaqMasterMix（康為世紀），10μmol/L正反引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O補至25μL。PCR反應程序為94℃預變性2min;94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán);72℃延伸2min，16℃結(jié)束反應。擴增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.3數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計電泳結(jié)果，利用PowerMarker3.25軟件分析每個標記所產(chǎn)生的等位基因數(shù)、有效等位基因頻率、雜合度、基因多樣性和多態(tài)性信息含量（PIC）等;用NTSYS2.1軟件進行遺傳相似系數(shù)計算，同時用2種軟件中的UPGMA方法進行樹狀圖分析及聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1InDel標記多態(tài)性分析

從筆者所在實驗室前期開發(fā)出的10470個InDel標記中初步選擇68對InDel標記對48份黃瓜自交系進行分析，結(jié)果顯示，39對InDel標記具有強多態(tài)性，共擴增出79條多態(tài)性條帶，平均每對標記產(chǎn)生2.0256個多態(tài)性條帶。標記InDel250對48份黃瓜種質(zhì)材料擴增出2個等位基因的電泳（圖1）。48份黃瓜自交系中平均等位基因位點為2.0256，觀察的48份黃瓜自交系的雜合度為0～0.2083，標記InDel161的雜合度最高，為0.2083，標記InDel269的基因多樣性最高，擴增出3條帶，為擴增帶型數(shù)量最多的標記，且該標記擴增結(jié)果的多態(tài)性含量PIC值最高，為0.5246（表2）。

2.2基于InDel標記的黃瓜種質(zhì)遺傳多樣性分析

在48份黃瓜種質(zhì)資源中，遺傳距離的范圍在0～0.9551之間，其中D2與D3，D5與D18，D9與D11，D4與D15、D16的遺傳距離為0，說明這些材料可能為同一種質(zhì)資源，而X1與X2遺傳距離最大，達到0.9551，為比較理想的親本組合。利用NTSYS2.1軟件分析發(fā)現(xiàn)，48份黃瓜材料相似性系數(shù)變幅為0.44～1.00，平均相似性系數(shù)為0.72，說明其親緣關系較近，遺傳多樣性不夠豐富，遺傳背景相對狹窄。

采用NTSYS2.1軟件中的UPGMA對48份黃瓜種質(zhì)資源進行聚類分析作圖，結(jié)果見圖2。在相似性系數(shù)為0.44時，將黃瓜種質(zhì)劃分為2個類群，第1類群包括D1、D2、D3、D12、D5等31份材料，且大部分密刺黃瓜被聚為此類;第2類群包括X1、X3、X7、X4、X11等17份材料，且該類群76.5%為水果黃瓜;白綠黑刺黃瓜、白綠稀刺黃瓜全部在第一大類群，2份白綠無刺黃瓜在第二大類群。為了驗證NTYSYS軟件的分析結(jié)果，用PowerMarker3.25軟件進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)48份黃瓜自交系也是被聚為兩大類群（圖3），且聚類結(jié)果與上述NTSYS軟件分析結(jié)果完全一致。

3討論

近年來，分子標記因其不受環(huán)境條件影響而作為作物遺傳多樣性及親緣關系分析的有效工具。在黃瓜遺傳多樣性研究中，用RFLP、AFLP、SSR、EST-SSR、SNP等標記對黃瓜種質(zhì)的研究較多，雖然InDel標記具有在基因組內(nèi)分布廣、密度高、變異穩(wěn)定、多態(tài)性強、容易檢測等優(yōu)點，但其在黃瓜種質(zhì)研究中的報道較少。本研究選用68對InDel標記對48份黃瓜自交系進行遺傳多樣性分析，研究黃瓜種質(zhì)的親緣關系，為育種者提供相關有效信息。研究發(fā)現(xiàn)39對InDel標記具有強多態(tài)性且擴增帶型清晰，占所選標記的57.4%;39對標記在48份材料共檢測出79個等位基因，平均每對標記檢測到2.0256個等位基因，遺傳相似性系數(shù)在0.44～1.00之間，平均相似性系數(shù)為0.72，說明48份材料總體親緣關系較近，遺傳多樣性不夠豐富，該結(jié)果與相關報道的黃瓜遺傳背景狹窄研究結(jié)果[2，4，9]一致。

本研究利用UPGMA聚類分析，在相似性系數(shù)為0.44時，將48份供試黃瓜材料分為兩大類群，第一大類群包括大部分的刺密黃瓜，而第二大類群主要為水果黃瓜。在第一類群中刺密黃瓜D2與D3，D5與D18，D9與D11，D4與D15、D16的相似性系數(shù)高達1，遺傳距離為0，說明這些黃瓜材料遺傳背景更為相似，可歸為同一品系，表型上的差異可能為環(huán)境條件影響所致，也可能是因為本研究所選用的InDel標記與表型無直接關系。除去遺傳距離為0的材料外，其他種質(zhì)資源的遺傳距離在0.0064～0.9551范圍內(nèi)。此外，本研究中白綠黑刺黃瓜、白綠稀刺黃瓜，白綠無刺黃瓜分布在兩大類型中，表明它們的基因組可能是由密刺黃瓜和水果黃瓜變異而來，從該研究結(jié)果中可以很清晰地了解所選黃瓜材料的遺傳背景，指導育種人員進行雜交組配。水果黃瓜綠美1號的父母本X1、X2被劃分到不同類群中，且X1與X2的遺傳距離最大，二者的親緣關系較遠，且生產(chǎn)上綠美1號的品質(zhì)和產(chǎn)量均優(yōu)于親本，說明綠美1號雙親間存在雜種優(yōu)勢，類似的研究在水稻、胡蘿卜、玉米等作物上也有報道[17-19]，本研究首次從分子水平上揭示了親本材料的遺傳差異與黃瓜雜種優(yōu)勢的關系，為黃瓜育種和改良奠定了理論基礎。

本研究對48份黃瓜種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，聚類分析揭示了黃瓜種質(zhì)間的親緣關系，將指導育種中合理選擇親緣關系較遠的種質(zhì)進行雜交組合的配置，提高優(yōu)良組合選育，從而減少育種的盲目性，加快育種進程。

參考文獻：

[1]余冰，鄭志華，孔令云，等.加工黃瓜的標準化與質(zhì)量控制[J].中國農(nóng)學通報，2007，23（3）：109-112.

[2]MlikiA，StaubJE，SunZY，etal.Geneticdiversityinmelon（CucumismeloL.）：anevaluationofAfricangermplasm[J].GenetResourCropEvol，2001，48（6）：587-597.

[3]Lopez-seseAI，StaubJE，Gomez-guillamonML.GeneticanalysisofSpanishmelon（CucumismeloL.）germplasmusingastandardizedmolecularmarkerarrayandgeographicallydiversereferenceaccessions[J].TheorApplGenet，2003，108：41-52.

[4]StaubJE，Lopez-seseAI，F(xiàn)anourakisN.Diversityamongmelonlandraces（CucumismeloL.）fromGreeceandtheirgeneticrelationshipswithothermelongermplasmofdiverseorigins[J].Euphytica，2004，136（2）：151-166.

[5]EscribanoS，LazaroA，CuevasHE，etal.Spanishmelons（CucumismeloL.）oftheMadridprovenance：auniquegermplasmreservoir[J].GenetResourCrop&Evol，2012，59（3）：359-373.

[6]DijkhuizenA，KermardWC，HaveyMJ，etal.RFLPvariationandgeneticrelationshipsincultivatedcucumber[J].Euphytica，1996，90（1）：79-87.

[7]李錫香，朱德蔚，杜永臣，等.黃瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性及其親緣關系的AFLP分析[J].園藝學報，2004，31（3）：309-314.

[8]穆生奇，顧興芳，張圣平，等.栽培黃瓜種質(zhì)遺傳多樣性的SSR鑒定[J].園藝學報，2008，35（9）：1323-1330.

[9]劉俊青，李佩芳，胡建斌，等.用EST-SSR標記評價21份黃瓜種質(zhì)的遺傳多樣性[J].河南農(nóng)業(yè)大學學報，2011，45（6）：657-661.

[10]姚丹青，樓堅鋒，朱文瑩，等.基于SNP的黃瓜遺傳多樣性分析[J].上海農(nóng)業(yè)學報，2017，33（1）：21-30.

[11]潘存紅，王子斌，馬玉銀，等.InDel和SNP標記在水稻圖位克隆中的應用[J].中國水稻科學，2007，21（5）：447-453.

[12]張紅梅，翟文，金海軍，等.利用InDel標記分析23份黃瓜種質(zhì)[CM（25*2/3]的遺傳多樣性及核心種質(zhì)資源篩選[J].上海農(nóng)業(yè)學報，2019，35（4）：28-33.

[13]青闊，張桂華，王永，等.基于InDel標記快速檢測黃瓜津優(yōu)38種子純度[J].種子，2011，30（6）：19-23.

[14]吳迷，汪念，沈超，等.基于重測序的陸地棉InDel標記開發(fā)與評價[J].作物學報，2019，45（2）：196-203.

[15]胡陶鑄，林麗，胡繼軍，等.利用InDel標記構(gòu)建番茄新品種指紋圖譜[J].上海交通大學學報（農(nóng)業(yè)科學版），2019，37（2）：24-29.

[16]聶京濤，李曉丹，姚永康，等.用于黃瓜白粉病抗性鑒定的InDel標記[J].中國蔬菜，2015，1（9）：26-30.

[17]PhetmanysengX，XieF，HernandezJE，etal.HybridriceheterosisandgeneticdiversityofIRRIandLaorice[J].FieldCropsResearch，2010，117：18-23.

[18]JagozB.TherelationshipbetweenheterosisandgeneticsdistancebasedonRAPDandAFLPmarkersincarrot[J].PlantBreeding，2011，130（5）：574-579.

[19]楊亞桐，董安憶，劉松濤，等.基于SSR分子標記的糯玉米遺傳多樣性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2020，48（2）：83-86.