管娟，劉珺，秦文

(武漢市精神衛(wèi)生中心十五病區(qū)精神科，湖北 武漢 430014)

精神分裂癥是一種常見的精神類疾病，其終生患病風(fēng)險(xiǎn)接近1%[1]。目前，精神分裂癥的診斷主要基于評(píng)估患者的臨床癥狀和行為，但其病理生理學(xué)和生化指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)還未得到有效利用。miRNAs是一類內(nèi)源性短鏈非編碼RNA，參與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[2-3]。miRNAs不僅可以調(diào)節(jié)眾多重要的生物學(xué)功能，還參與了幾乎所有的生命過程[4-5]。并且miRNAs的表達(dá)水平可以反映了精神分裂癥等精神疾病在遺傳和生物學(xué)方面的改變[6-8]。盡管精神分裂癥的病因尚未明確，但在精神分裂癥患者的腦組織、外周血、血清、血漿中均可檢測(cè)到miRNAs的異常表達(dá)[9-10]。而Sullivan等[11]指出，miRNAs在全血和腦組織中的表達(dá)相似。Harris等[12]也發(fā)現(xiàn)，血液中生物標(biāo)志物的變化可反映大腦的病理過程。由于患者腦組織不易獲得，對(duì)精神分裂癥的病理生理學(xué)和潛在的生物標(biāo)志物的研究越來越依賴于血液中miRNA表達(dá)[13]。因此，本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及相關(guān)數(shù)據(jù)庫初步篩選出14個(gè)候選miRNAs，通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)進(jìn)一步驗(yàn)證其在精神分裂癥中表達(dá)情況，并采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)分析其對(duì)精神分裂癥的診斷價(jià)值。為了闡明存在差異表達(dá)的miRNAs的功能及相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，采用生物信息學(xué)進(jìn)一步分析其相關(guān)的作用途徑和調(diào)控的靶基因，為進(jìn)一步深入研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

數(shù)表法隨機(jī)選取2018年10月至2019年10月武漢市精神衛(wèi)生中心收治的40例精神分裂癥患者作為觀察組。其中，男性26例，女性14例；年齡18～60歲，平均(43.25±6.13)歲；病程(3.21±2.04)年；疾病分類中偏執(zhí)型25例、殘留型4例、未分化型7例、其他4例。所有患者均符合美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)(第4版)修訂版的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有受試者均由至少兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的精神病學(xué)家診斷為精神分裂癥患者。研究獲得武漢市精神衛(wèi)生中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18周歲；(2)符合精神分裂癥相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)未治療期不超過兩年；(4)臨床資料完整者；(5)治療前，患者或家屬同意抽取血樣，進(jìn)行后續(xù)研究者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重心、腦、肝等系統(tǒng)性疾病者；(2)長(zhǎng)期服用抗精神病藥物者；(3)合并嚴(yán)重軀體疾病者；(4)合并感染、免疫類疾病者。另選武漢市精神衛(wèi)生中心同期40名健康體檢者作為對(duì)照組。兩組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)及受教育年限等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

1.2 方法

1.2.1 外周血的采集 80名受試者于治療前清晨空腹采集外周血5 mL，并收集于乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管中。立于冰上30 min后，吸出上清。10 000 g離心5 min，棄沉淀。取上清保存于-80 ℃，待提取總RNA。

1.2.2 miRNA的篩選 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和相關(guān)數(shù)據(jù)庫初步篩選出14個(gè)候選miRNAs，分別為miR-30d-5p、miR-181b-3p、miR-652-5p、miR-193a-3p、miR-181b-5p、miR-34a-5p、miR-346、miR-572、miR-7-5p、miR-449a、miR-564、miR-22-3p、miR-548d-3p和miR-30a-5p。

表1 兩組一般資料比較

1.2.3 RNA提取和miRNA定量RT-qPCR 使用miRcute血清/血漿miRNA提取分離試劑盒(DP503，天根生化科技有限公司，北京)提取總RNA。采用Nanodrop光譜儀(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)檢測(cè)RNA純度和濃度。隨后，使用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)將RNA反向轉(zhuǎn)錄為cDNA(Thermo Scientific，CA，USA)。采用RT-qPCR 2 x SYBR qPCR Mix(北京中曼生物技術(shù)有限公司，中國(guó))檢測(cè)miRNA的水平。擴(kuò)增體系如下：PCR反應(yīng)包含2 μL cDNA、0.4 μL正向引物、0.4 μL反向引物、7.2 μL H2O2和10 μL SYBR Green核酸染料；擴(kuò)增條件為25 ℃ 10 min、48 ℃ 30 min、95 ℃ 5 min，U6作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參。每個(gè)樣本檢測(cè)3次，采用2-ΔΔCt法分析miRNA的表達(dá)水平[14]，首先計(jì)算出每個(gè)樣品內(nèi)參基因的表達(dá)量ΔCt，再計(jì)算對(duì)照組中ΔCt的均值，用觀察組每個(gè)樣品的ΔCt減去對(duì)照組的ΔCt均值，得到ΔΔCt，采用2-ΔΔCt公式計(jì)算出觀察組的表達(dá)量。miRNAs和U6引物信息見表2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.4 生物信息學(xué)分析

為了進(jìn)一步研究miRNAs的功能作用，對(duì)具有差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以確定可能的miRNA靶基因。采用Target Scan和miRanda預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。利用京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，https://www.genome.jp/kegg/)和注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)基因進(jìn)行通路和功能富集分析。通過上述軟件自帶的分析工具，采用Fisher精確檢驗(yàn)來識(shí)別KEGG中富集基因的靶向通路。

表2 miRNAs和U6引物信息

根據(jù)生物信息學(xué)分析，SATB2，PER2和SAMD12是差異表達(dá)的miRNAs的關(guān)鍵靶基因。采用RT-qPCR方法檢測(cè)三個(gè)基因的表達(dá)情況。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，每個(gè)樣本檢測(cè)3次，采用2-ΔΔCt法分析其表達(dá)情況[14]。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者外周血miRNAs表達(dá)水平比較

兩組受試者外周血miR-30d-5p、miR-181b-3p、miR-652-5p、miR-193a-3p、miR-181b-5p、miR-346、miR-572、miR-7-5p、、miR-564、、miR-548d-3p和miR-30a-5p表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且觀察組miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組受試者外周血miRNAs表達(dá)水平比較

2.2 miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p對(duì)精神分裂癥的診斷價(jià)值

通過ROC曲線分析miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p對(duì)精神分裂癥的診斷價(jià)值，miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p 的AUC值分別為0.763，0.659和0.725，均大于0.6，三者聯(lián)合檢測(cè)的AUC值為0.802。見圖1。

2.3 miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p靶基因功能注釋及通路分析

miR-34a-5p靶基因主要存在于細(xì)胞核質(zhì)，參與突觸導(dǎo)向、神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移、多巴胺能神經(jīng)突觸相關(guān)信號(hào)通路等。miR-449a靶基因主要存在于神經(jīng)元胞體，參與化學(xué)突觸傳遞、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸小泡循環(huán)通路等。miR-22-3p靶基因主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，參與突觸增強(qiáng)、神經(jīng)元遷移、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路等。見表4。

表4 miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p靶基因功能注釋及通路分析

2.4 miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p共同靶向基因的表達(dá)情況

通過生物信息學(xué)分析，miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p共同靶基因?yàn)镾ATB2，PER2和SAMD12(圖2A)。采用RT-qPCR分析兩組SATB2，PER2和SAMD12表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，觀察組SATB2(0.46±0.06)和PER2(0.39±0.05)水平與對(duì)照組比較明顯降低(1.13±0.12；1.03±0.11)(P<0.05)，SAMD12表達(dá)水平兩組無明顯差異(P>0.05)。見圖2B-2D。

3 討論

精神分裂癥是一種異質(zhì)性精神病，具有廣泛的臨床和生物學(xué)表現(xiàn)。但由于缺乏客觀的測(cè)試，對(duì)于精神分裂癥的準(zhǔn)確診斷和有效治療的臨床選擇仍然具有一定的挑戰(zhàn)性[15]。本研究證實(shí)miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p在精神分裂癥患者外周血中表現(xiàn)出顯著變化，提示它們可能在精神分裂癥的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。既往研究[16-20]表明，miR-34a在神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)分化方面具有顯著的作用，并且精神障礙患者腦組織中的miR-34a表達(dá)異常。另外，眾多研究[21-23]也證實(shí)miR-449和miR-34b/c在大腦發(fā)育中起著重要作用。但是，miR-22-3p在精神分裂癥中的作用研究較少，miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p對(duì)精神分裂癥的綜合影響也尚未完全清楚。

Target Scan和miRanda是被廣泛用于預(yù)測(cè)miRNAs靶向基因的在線軟件。根據(jù)Target Scan和miRanda的預(yù)測(cè)，本研究對(duì)miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p的靶基因進(jìn)行通路和基因功能分析，結(jié)果表明，miR-34a-5p靶基因主要存在于細(xì)胞核質(zhì)，參與突觸導(dǎo)向、神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移、多巴胺能神經(jīng)突觸相關(guān)信號(hào)通路等。miR-449a靶基因主要存在于神經(jīng)元胞體，參與化學(xué)突觸傳遞、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸小泡循環(huán)通路等。miR-22-3p靶基因主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，參與突觸增強(qiáng)、神經(jīng)元遷移、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路等。而精神分裂癥是一種起源于神經(jīng)發(fā)育的復(fù)雜疾病，其特征是皮層和皮層下突觸可塑性異常，神經(jīng)遞質(zhì)(包括多巴胺、谷氨酸和血清素)的異常表達(dá)，以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能障礙等[24-25]。miRNA已成為基因表達(dá)調(diào)控中必不可少的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，在大腦發(fā)育和神經(jīng)可塑性中的重要性已得到公認(rèn)。另外本研究通過生物信息學(xué)分析，miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p共同靶基因?yàn)镾ATB2，PER2和SAMD12。通過RT-qPCR進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者SATB2和PER2水平與健康對(duì)照組比較明顯降低，miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p可能通過直接作用于SATB2和PER2基因參與精神分裂癥的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p在精神分裂癥中異常表達(dá)。通過ROC曲線分析提示這3種miRNAs結(jié)合可作為精神分裂癥診斷的生物標(biāo)志物。基因通路和功能分析顯示，miR-34a-5p、miR-449a和miR-22-3p靶基因與突觸結(jié)構(gòu)和神經(jīng)功能密切相關(guān)，在精神分裂癥的病因?qū)W和病理生理學(xué)中發(fā)揮重要作用，也可能作為精神分裂癥診斷規(guī)范和治療監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)記。