宋金云 趙宏宇

隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展以及乙型肝炎疫苗的普及，傳染性肝病的發(fā)病率逐漸下降，而不明原因肝病患者呈增多趨勢(shì)?！安幻髟蚋尾　笔侵笩o(wú)誘因的持續(xù)或反復(fù)肝功能生化指標(biāo)異常，或肝臟影像學(xué)檢查異常，通過(guò)常規(guī)的病史詢問(wèn)、體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查仍不能明確病因，部分患者因不能及時(shí)明確病因而延誤治療，導(dǎo)致病情持續(xù)進(jìn)展[1]。

不明原因肝損傷病因繁多，常見(jiàn)的有：非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、藥物性肝損傷(DILI)、自身免疫性肝病[包括自身免疫性肝炎(AIH)、原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)]、遺傳性代謝性肝病(Caroli綜合征、Alagilli 綜合征、先天性膽道閉鎖等遺傳性發(fā)育異常，以及肝組織銅、鐵、卟啉、氨基酸、尿素、糖、果糖、乳糖、脂蛋白和脂質(zhì)、膽紅素、膽汁酸等代謝異常引起的肝臟疾病)、膽汁淤積性肝病、血管性肝病(累及肝靜脈、門靜脈、肝動(dòng)脈及其分支的疾病)以及感染性病因(如隱匿性肝炎病毒感染，非嗜肝病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲等的感染)。此外其他系統(tǒng)疾病也可累及肝臟，如心血管疾病、內(nèi)分泌疾病、血液系統(tǒng)疾病和結(jié)締組織病等[2-3]。

生物樣本庫(kù)建設(shè)是臨床醫(yī)學(xué)研究的基石，它作為基礎(chǔ)研究成果向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的平臺(tái)，在疾病診斷、新藥研發(fā)、疾病相關(guān)基因檢測(cè)及流行病學(xué)研究中均有重要作用[4-5]。有效的生物樣本是開展基礎(chǔ)研究的前提，基于此，不明原因肝病生物樣本庫(kù)收集和存儲(chǔ)我院肝病科不明原因肝病住院患者的血漿、白膜層以及外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)樣本，并將樣本捐獻(xiàn)者的臨床信息和樣本的編碼信息錄入南京市多中心生物樣本庫(kù)系統(tǒng)，為不明原因肝病的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)樣本和詳細(xì)的臨床資料。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2018年7月至2019年6月于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第二醫(yī)院)肝病科就診的肝功能異常住院患者，通過(guò)病史、各種常規(guī)化驗(yàn)及輔助檢查不能明確病因，均行肝穿刺活檢，共191例，其中男性67例，女性124例。本生物樣本庫(kù)通過(guò)了南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第二醫(yī)院)倫理委員會(huì)審查，所有研究對(duì)象均簽署了知情同意書。

二、主要儀器耗材

-196 ℃液氮罐(Thermo)、-80 ℃超低溫冰箱(DW-HL668)、冷鏈監(jiān)控系統(tǒng)(Haier)、低溫生物標(biāo)本轉(zhuǎn)移箱(BIO-CARRIER)、低溫離心機(jī)(Thermo Scientific SL 16R)、制冰機(jī)(GRANT)、電泳儀(DYY-2C)、凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-1600)、超微量分光光度計(jì)(Thermo)、條碼打印機(jī)(L-MARK)、掃碼槍(Honeywell)、凍存管和凍存盒(萬(wàn)格)。

三、樣本的采集、處理與保存

采集不明原因肝病住院患者全血樣本各兩管，每管5 mL，樣本采集后立即置于低溫生物標(biāo)本轉(zhuǎn)移箱，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，由生物樣本庫(kù)專職人員離心分裝：①3 500 r/min離心10 min，分離血漿與白膜層，血漿分裝凍存管4～10管，200 μL/管。白膜層分裝凍存管1～2管，400 μL/管；②根據(jù)臨床工作的具體情況，按照標(biāo)準(zhǔn)步驟提取PBMC。所有樣本均在生物安全柜中分裝，并分別在凍存管上貼上條碼標(biāo)簽。

四、樣本入庫(kù)與信息管理

樣本庫(kù)專職人員登錄南京市多中心生物樣本庫(kù)系統(tǒng)，對(duì)樣本實(shí)行條碼掃描存儲(chǔ)，錄入患者的一般信息(住院號(hào)、姓名、性別、年齡、民族、聯(lián)系方式、臨床診斷、病理診斷、治療方案、隨訪信息等)、樣本信息(樣本類型、樣本編號(hào)、入庫(kù)時(shí)間、位置登記號(hào)等)以及肝穿刺病理信息。

五、樣本質(zhì)量控制

DNA和RNA通常作為生物樣本質(zhì)量分析的標(biāo)準(zhǔn)，抗凝血中的白膜層是體細(xì)胞核酸的主要來(lái)源[6-7]。隨機(jī)抽取5例白膜層樣本，按照Qiagen QIAamp DNA Mini Kit說(shuō)明書提取樣本DNA，按照Trizol抽提法提取樣本RNA。

結(jié) 果

一、樣本收集情況

自2018年7月至2019年6月，生物樣本庫(kù)共納入不明原因肝病患者191例，183例患者得到明確診斷，其中NAFLD 42例(21.98%)，PBC 20例(10.47%)，DILI 30例(15.71%)，AIH 29例(15.18%)，血管性肝病20例(10.47%)，酒精性肝病7例(3.66%)，重疊綜合征12例(6.28%)，膽汁淤積性肝病11例(5.76%)，遺傳性代謝性肝病5例(2.62%)，感染性病因3例(1.57%)，其他系統(tǒng)疾病4例(2.09%)，原因未明8例(4.19%)。不明原因肝病生物樣本庫(kù)共收集了2 007份樣本，其中血漿樣本1 625份，白膜層樣本333份，PBMC樣本49份。同一患者收取的樣本類型根據(jù)臨床工作的具體情況而定，并非所有樣本全部收取。

二、樣本質(zhì)量控制

DNA質(zhì)量鑒定：從現(xiàn)存的樣本中隨機(jī)抽取5例白膜層樣本。將抽提的DNA 經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳后可見(jiàn)條帶清晰(圖A)，無(wú)明顯 DNA 降解，證明所存儲(chǔ)標(biāo)本的 DNA 質(zhì)量良好。

RNA質(zhì)量鑒定：從現(xiàn)存的樣本中隨機(jī)抽取5例白膜層樣本，將抽提的總 RNA 經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳后，基本上可見(jiàn)明顯的 28 s 和 18 s 條帶(圖B)，且28 s 條帶的亮度為 18 s 亮度的 1.5～2.0 倍。提示 RNA 保存效果良好。

圖 隨機(jī)抽取5例白膜層樣本的DNA和RNA電泳圖

討 論

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，在進(jìn)行個(gè)性化治療和臨床研究時(shí)越來(lái)越離不開生物樣本的支持，生物樣本庫(kù)資源及其臨床數(shù)據(jù)庫(kù)受到廣泛重視[8-9]。人體生物樣本庫(kù)在國(guó)外已有多年歷史，已經(jīng)建立了血清生物樣本庫(kù)以及組織庫(kù)[10-11]，國(guó)內(nèi)樣本庫(kù)處于初級(jí)階段，目前黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科生物樣本庫(kù)[5]、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院結(jié)直腸腫瘤生物樣本庫(kù)[12]、湖北省中醫(yī)院超重/肥胖人群生物樣本庫(kù)[4]、中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院生物樣本庫(kù)[7]等樣本庫(kù)已經(jīng)初步建立，但是針對(duì)不明原因肝病人群的生物樣本庫(kù)建設(shè)較少見(jiàn)。

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院作為江蘇省唯一的三級(jí)甲等傳染病醫(yī)院，肝病患者較多，這為我院的不明原因肝病生物樣本庫(kù)提供了寶貴的樣本資源。為了收集和整合肝病科室分散的臨床資源，由肝病專家楊永峰建立的不明原因肝病研究團(tuán)隊(duì)牽頭，南京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)費(fèi)支持，我院于 2016 年底開始籌建不明原因生物樣本庫(kù)。我院樣本庫(kù)收集的191例患者中NAFLD、DILI和AIH患者占了較大比例，這與國(guó)內(nèi)張思敏等[13]研究結(jié)果相一致。

高質(zhì)量生物樣本的使用，是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵因素，所以生物樣本的質(zhì)量控制是樣本庫(kù)的關(guān)鍵[14-15]。根據(jù)我院實(shí)際情況，不明原因肝病生物樣本建立了規(guī)范化的樣本收集流程，同時(shí)定期對(duì)樣本進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。本研究中隨機(jī)抽樣檢測(cè)的5例樣本核酸均無(wú)明顯降解，證明按照目前收集存儲(chǔ)管理流程收集的不明原因肝病生物樣本質(zhì)量良好，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。

我院不明原因肝病生物樣本現(xiàn)為建設(shè)初期，在建設(shè)過(guò)程中也總結(jié)了一些經(jīng)驗(yàn)和遇到的問(wèn)題：①在標(biāo)本采集過(guò)程中，樣本離體時(shí)間和樣本入庫(kù)時(shí)間是影響樣本質(zhì)量的關(guān)鍵因素。因此，我們有專職工作人員配合醫(yī)生護(hù)士，確保血漿和白膜層樣本離體后能在2 h內(nèi)存入超低溫冰箱，避免樣本核酸降解和蛋白異常表達(dá)。樣本存儲(chǔ)后，確定樣本質(zhì)量是否合格，為后續(xù)進(jìn)行科學(xué)研究提供高質(zhì)量標(biāo)本。②臨床醫(yī)生重視度不夠，留取樣本積極性不高。因此，我們定期對(duì)臨床醫(yī)生開展樣本庫(kù)介紹，推廣樣本庫(kù)共享理念，鼓勵(lì)臨床醫(yī)生收集樣本，溝通科研設(shè)計(jì)思路。③加強(qiáng)樣本庫(kù)工作人員培訓(xùn)力度，定期進(jìn)行業(yè)務(wù)知識(shí)培訓(xùn)，執(zhí)行樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化收集與管理流程。

我院初步建立了不明原因肝病生物樣本庫(kù)，制定了標(biāo)準(zhǔn)化的樣本庫(kù)運(yùn)行和管理規(guī)章制度，每一份樣本都攜帶完整的臨床信息。同時(shí)，在不斷整合本院自身資源的同時(shí)，與國(guó)內(nèi)多個(gè)分中心建立長(zhǎng)期良好合作關(guān)系，深入開展不明原因肝病的基礎(chǔ)研究，為今后不明原因肝病的進(jìn)一步研究提供高質(zhì)量的樣本資源，對(duì)研究不明原因肝病具有十分重要的意義。