周春旭，張 欣，耿曉宇

(通化師范學(xué)院·吉林通化·134002)

王不留行，又叫做麥藍(lán)菜、奶米、剪金花、大麥牛，為石竹科植物麥藍(lán)菜（Vaccaria segetalis）的干燥成熟種子。具有活血通經(jīng)，下乳消癰，利尿通淋的功效。用于經(jīng)閉，痛經(jīng)，乳汁不下，乳癰腫痛，淋證澀痛[1]。王不留行本身含有多種化合物，本課題致力于研究王不留行中的活性成分，發(fā)現(xiàn)了王不留行中含有的多糖成分具有非常高的利用價(jià)值[2]，多糖具有抗腫瘤、降血糖和降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老等多種藥理作用[3-7]，考慮到王不留行可以經(jīng)過炮制加工[8-9]，故研究王不留行在炮制前后多糖含量有何變化，為王不留行在醫(yī)療上的利用提供更多的參考價(jià)值，同時(shí)也增加了王不留行的藥用資源途徑。

多糖的提取方法很多如水提法、酸堿提法、超聲提取法、生物酶提取法、微波提取法等[10-12]。對于多糖的測定，有苯酚-硫酸法，蒽酮-硫酸法，DNS法等方法[12-16]。本實(shí)驗(yàn)將通過對比來選擇更為高效、安全的測定方法進(jìn)行試驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 藥品和試劑

王不留行（購于通化市醫(yī)藥大廈）生品100g；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品；DNS試劑；6mol·L-1的HCl溶液；6mol·L-1的NaOH溶液；無水乙醇。

1.2 儀器

電子天平；粉碎機(jī)；真空泵；722N紫外可見分光光度計(jì)；TW-3000W電爐。

2 方法與結(jié)果

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的配制

將105℃干燥至恒重的50mg的葡萄糖對照品置于100mL容量瓶中定容后搖勻得到0.5mg·mL-1葡萄糖溶液備用；取兩份王不留行生品50g分別進(jìn)行未處理和炮制（清炒），得到炮制品42.3g，分別進(jìn)行粉碎，放于干燥處以便使用。

2.2 DNS試劑的配制

在由181g酒石酸鉀鈉配制出的500mL得溶液中倒入6.2gDNS和2mol·mL-1氫氧化鈉263mL溶液和5g重蒸苯酚和5g無水亞硫酸鈉，利用玻璃棒攪動混勻后放涼至常溫后再將其移入到1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度并搖勻后貯存在棕色瓶當(dāng)中，置于昏暗陰涼處等待7天方能使用。

2.3 DNS法的原理

在中性或是偏堿性的條件下，3，5-二硝基水楊酸與多糖水解出的還原糖共熱后能夠被還原成棕紅的3-氨基-5-硝基水楊酸，在一定的程度內(nèi)，還原糖含量與反應(yīng)液的顏色呈現(xiàn)出正相關(guān)[17]。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在準(zhǔn)備好的7支試管當(dāng)中分別加入配置好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL后加入蒸餾水至試管內(nèi)溶液為1mL為止，再于各個(gè)試管中分別倒入2mL的DNS后將其放入燒沸的水中水浴加熱5min，拿出后迅速放到流水下使之變涼后再于490nm處測定各個(gè)試管的吸光度，空白調(diào)零，繪制出一條以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)、吸收度為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，詳見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 供試品溶液的制備

利用電子天平稱取備好的王不留行的粉末，分別為生品粉末和炮制品粉末各50g。通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到最適的多糖提取實(shí)驗(yàn)條件為溫度100℃，分別水提次

數(shù)3次，提取時(shí)長2h，水料比為10∶1[18]，用500mL 95%的乙醇醇沉提取出的用濾布過濾后并濃縮至100mL的溶液，口部密封并冷藏于冰箱中24h后抽濾出沉淀經(jīng)干燥后研磨備用，將剩余乙醇回收裝好。稱得生品王不留行的多糖提取物為10.68g。炮制品王不留行多糖提取物為7.56g。

總提取率（%）=（提取物質(zhì)量/原料質(zhì)量）*100%=10.68/50（g）*100%=21.36%

總提取率（%）=（提取物質(zhì)量/原料質(zhì)量）*100%=7.56/50（g）*100%=17.7%

2.5.1 還原糖溶液制備

將生品多糖提取物和炮制品多糖提取物分別取1g加入到100mL水中備用，為還原糖待測液。

2.5.2 總糖溶液制備

取還原糖待測液20mL，倒入配置好的10mL 6mol·L-1的HCl溶液，搖晃至均勻，將瓶子口密封好，將水燒至沸騰，將其沸水浴30min，取出后，冷卻至室溫，將配置好的6mol·L-1的NaOH溶液逐滴加入，直至pH調(diào)到8.0，將其放入4000r·min-1的離心機(jī)中離心5min，利用清水洗滌剩余的殘?jiān)?，將上清液和水洗滌液一起置?0mL的容量瓶當(dāng)中后用蒸餾水定容至刻度并搖勻即得到總糖的水解樣品。

2.6 DNS法測定多糖含量

分別從王不留行生品還原糖待測液、總糖待測液、以及王不留行炮制品還原糖待測液、總糖待測液取1mL樣品于25mL容量瓶中，再各加2mLDNS，沸水浴5min，在流水下冷卻后加水至刻度，于490nm下測定吸光度。平行設(shè)置3次相同實(shí)驗(yàn)，取平均值，即為最后的結(jié)論。

測得生品王不留行吸光度還原糖為0.372，總糖為0.532，炮制品還原糖為0.287，總糖為0.614，帶入到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線后得到含量分別為4.38%，14.7%，4.46%，23.14%。王不留行生品多糖=總糖-還原糖=10.32%，即生品50g王不留行中含有多糖為2.06%。王不留行炮制品多糖=總糖-還原糖=23.14%，即炮制品王不留行中含有多糖3.32%。詳見表1。

表1 王不留行多糖含量結(jié)果

2.7 精密度試驗(yàn)

在紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行0.5mL的葡萄糖對照品溶液吸光度測定，并設(shè)置8組平行實(shí)驗(yàn)。可以表明精密度良好。詳見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將稱取好的王不留行生品5g按2.5.2項(xiàng)操作顯色后分別于0、5、10、15、20、25、30min后測定吸光度，結(jié)果生品總糖平均為0.532，RSD=0.28%，炮制品總糖為0.615，RSD=0.28%，可見穩(wěn)定性良好。詳見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

按照制備還原糖供試溶液分別依法測定5份同一批樣品。結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.10 回收率試驗(yàn)

將稱量好的0.3g的葡萄糖分別加入到每份約為1.5g多糖含量的5份樣品當(dāng)中去，按2.5.2項(xiàng)方法操作后結(jié)果顯示平均加樣回收率為100.12%，RSD=1.38%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。結(jié)果見表5。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

在多糖含量測定的過程中，通常方法是用苯酚-硫酸法或硫酸-蒽酮比色法，但這兩種方法有一個(gè)共同點(diǎn)，就是都只能測定總糖含量，需要被測的多糖純度很高，如果樣品純化地不完全，單糖去除的不徹底，測量結(jié)果會出現(xiàn)誤差[19]；且硫酸具有腐蝕性，存在安全隱患，針對這些問題的綜合考慮，DNS法是最優(yōu)選擇，能夠使測定結(jié)果更為準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)過程更為安全。實(shí)驗(yàn)中，由于多糖不水解無法與DNS進(jìn)行反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)先將多糖水解后，使其具備了還原性，所以顯色后的結(jié)果實(shí)為還原糖的含量，因還原糖與多糖含量之和即為總糖含量。所以本實(shí)驗(yàn)通過測定還原糖和總糖的含量，便能夠得到多糖的含量結(jié)果。

結(jié)果可以看出，王不留行炮制后多糖含量有所升高。經(jīng)方法學(xué)考察驗(yàn)證結(jié)果表明，樣品的系統(tǒng)適用性好，儀器精密度良好、重現(xiàn)性好、回收率高，可滿足含量測定的要求。以期為評價(jià)王不留行藥材的質(zhì)量控制提供資料。