鮮雪梅，馮 沖，郭雨慧，王 茜

（阿壩師范學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，四川汶川 623002）

膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)含量豐富、分布廣泛的一種糖蛋白，約占動(dòng)物機(jī)體內(nèi)總蛋白含量的25%～30%，具有良好的生理特性和活性[1]。膠原蛋白在食品[2]、醫(yī)藥[3]、化妝品[4-5]等領(lǐng)域都具有較大的應(yīng)用價(jià)值。常見(jiàn)的膠原蛋白來(lái)源主要為豬、牛等陸生動(dòng)物，但因瘋牛病、口蹄疫等動(dòng)物傳染性疾病的潛在威脅，人們對(duì)這些動(dòng)物來(lái)源的膠原蛋白有一定的顧慮[6]。研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)皮中含有豐富的蛋白質(zhì)，其含量高于機(jī)體其他部位，膠原蛋白質(zhì)的含量達(dá)到總蛋白質(zhì)含量的80%以上[7]。魚(yú)皮可作為膠原蛋白的潛在可靠來(lái)源，以滿足膠原蛋白市場(chǎng)的巨大需求。

目前提取魚(yú)皮膠原蛋白的方式主要有4類，分別是熱水浸提、酸法提取、堿法提取和酶法浸提[8]。水提取法是常見(jiàn)的提取魚(yú)皮膠原蛋白的方法，其機(jī)制是用溫水進(jìn)行溫浸，再回流，最后通過(guò)高壓蒸煮從魚(yú)皮中獲得膠原蛋白[9]。趙睿等[10]用熱水進(jìn)行了鱈魚(yú)皮膠原蛋白的提取，采用響應(yīng)面法得到的最大提取率為43.75%。JAMILAH等[11]用水提法提取黑、紅羅非魚(yú)皮膠原蛋白，提取率僅為5.39%和7.81%。水提取法對(duì)實(shí)驗(yàn)的操作能力要求較高，且高溫下膠原蛋白易變性，因此不建議使用該方法[9]。酸提取法的原理是魚(yú)皮中的各種相關(guān)成分在酸性環(huán)境下溶解度不同，在一定的條件下可通過(guò)酸性試劑提取分離，常使用的酸性提取試劑有乳酸、乙酸、鹽酸和檸檬酸等[9]。王晴等[12]用乙酸提取羅非魚(yú)魚(yú)皮的膠原蛋白，得率為3.12%。傅燕鳳等[13]使用酸性試劑（醋酸、檸檬酸、乳酸）分別提取了鰱魚(yú)、鳙魚(yú)和草魚(yú)3種魚(yú)皮中的膠原蛋白，提取率分別是20.0%、21.1%、25.5%。酸提取法法對(duì)實(shí)驗(yàn)操作能力要求較高，時(shí)間也較長(zhǎng)，在大量消耗原材料的情況下，得到的提取率并不高[9]。堿提取法提取魚(yú)皮膠原蛋白的機(jī)制是把魚(yú)皮進(jìn)行破碎勻漿后，加入一定濃度的堿性試劑振蕩，過(guò)濾沉淀后，再進(jìn)行高速離心操作，最后冷凍干燥得到產(chǎn)物[8]。用堿性試劑提取膠原蛋白質(zhì)的文獻(xiàn)資料較少，很多是與其他提取方式結(jié)合共同提取。KOLODZIEJSKA等[14]用氫氧化鈉和過(guò)氧化氫進(jìn)行魷魚(yú)皮膠原蛋白的提取，提取率為53%。溫慧芳等[15]用氫氧化鈣提取鮰魚(yú)皮膠原蛋白，最佳提取率為79.67%。堿性提取法操作步驟簡(jiǎn)單，但此種方法會(huì)抑制膠原蛋白的活性，且產(chǎn)生的廢液也要妥善處理才不會(huì)污染自然環(huán)境[16]。酶提取法具有破壞性小、提取率高，對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，且得到的膠原蛋白具有活性。酶在特定的反應(yīng)條件下會(huì)對(duì)膠原蛋白產(chǎn)生限制性降解作用，切割末端肽，保留其中三股螺旋主體結(jié)構(gòu)，溶解于低濃度的酸性溶液和中性溶液中，膠原蛋白易被提取出[17]。木瓜酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶與堿性蛋白酶等是酶提取法使用頻率較高的酶[18-19]。此外，部分研究還將微波、超聲波、離子液體和多級(jí)逆流提取等輔助手段應(yīng)用于膠原蛋白提取[9]。超聲波技術(shù)是一種對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染的技術(shù)，它可以提高魚(yú)皮組織內(nèi)各種細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速率，超聲后的魚(yú)皮細(xì)胞破碎程度加大，更多的目標(biāo)物溶出，使提取效率明顯升高[20-21]。李志洲等[22]用超聲波輔助酶法提取鱔魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白，提取率達(dá)92.4%。王希等[23]用超聲波結(jié)合胃蛋白酶提取鱈魚(yú)皮膠原蛋白，得率為33.75%。

鯽魚(yú)（Carassius auratus）具有來(lái)源廣泛、價(jià)格低、膠原蛋白含量高等優(yōu)點(diǎn)，鯽魚(yú)皮可作為提取膠原蛋白的良好材料，目前關(guān)于超聲波輔助酶法提取鯽魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白質(zhì)的報(bào)道較少[24]。本研究以鯽魚(yú)魚(yú)皮為提取材料，探究超聲-雙酶法（風(fēng)味蛋白酶與堿性蛋白酶）提取鯽魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白的最佳條件，通過(guò)與雙酶法（風(fēng)味蛋白酶與堿性蛋白酶）提取進(jìn)行比較，優(yōu)化提取方法，為后續(xù)相關(guān)研究提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活健康鯽魚(yú)、堿性蛋白酶（20 000 U/g）、風(fēng)味蛋白酶（50 000 U/g）、磷酸氫二鈉、3 mol/L硫酸、6 mol/L鹽酸、異丙醇、磷酸二氫鉀、高氯酸、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、氯胺T和蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

分光光度計(jì)、鼓風(fēng)干燥箱、超聲波清洗機(jī)、分析天平、電熱恒溫水浴鍋和高速離心機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 鯽魚(yú)魚(yú)皮的預(yù)處理

在實(shí)驗(yàn)室條件下將鯽魚(yú)魚(yú)皮剝離切塊，將塊狀鯽魚(yú)皮放入10%的異丙醇溶液中浸泡24 h，除去鯽魚(yú)魚(yú)皮中的脂肪，用清水反復(fù)沖洗，放入10%的氯化鈉溶液中，除去其中可溶性的雜質(zhì)蛋白，沖洗干凈，晾干備用[25]。

1.3.2 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考郭恒斌等[26]的方法，配制工作液。將 1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL和4.0 mL工作液與緩沖液、顯色劑混合，顯色后用調(diào)至560 nm波長(zhǎng)的分光光度計(jì)測(cè)定各工作液的吸光度值，根據(jù)得到的數(shù)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 鯽魚(yú)魚(yú)皮中羥脯氨酸含量的測(cè)定

精確稱取鯽魚(yú)魚(yú)皮樣品1 g放入碘量瓶底部，稱取過(guò)程中不能接觸或黏到瓶?jī)?nèi)壁上，加入鹽酸水解、活性炭吸附色素，過(guò)濾并定容到1 000 mL，取1 mL定容后的稀釋液，按照制作羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法和操作要求，加入各種試劑和顯色劑，在560 nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液的吸光度值，確定鯽魚(yú)魚(yú)皮中羥脯氨酸的含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值[26]。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)中羥脯氨酸含量的測(cè)定

取5個(gè)試管，每個(gè)試管中放入1 g鯽魚(yú)皮，以料液比1∶15（g∶mL），反應(yīng)溫度控制在45 ℃，反應(yīng)4 h，2種蛋白酶加入量均為4 000 U/g作為標(biāo)準(zhǔn)處理?xiàng)l件，分別進(jìn)行超聲處理40 min、50 min、 60 min、70 min和80 min，反應(yīng)完成后進(jìn)行離心，取1 mL上清液放入試管內(nèi)，用鹽酸水解3 h后，定容稀釋至20 mL，取1 ml稀釋液參考1.3.3步驟測(cè)定溶液的吸光度值，計(jì)算上清液中的羥脯氨酸含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，選取最適超聲時(shí)間作為實(shí)驗(yàn)超聲處理?xiàng)l件[27]。

取20只試管，分別準(zhǔn)確稱量放入1 g鯽魚(yú)皮，分為4組，分別以料液比[1∶5（g∶mL）、1∶10（g∶mL）、1∶15（g∶mL）、1∶20（g∶mL）和1∶25（g∶mL）]、風(fēng)味蛋白酶量（2 000 U/g、3 000 U/g、4 000 U/g、5 000 U/g和6 000 U/g）、堿性蛋白酶量（2 000 U/g、3 000 U/g、4 000 U/g、 5 000 U/g和6 000 U/g）、酶解溫度（35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃）為處理因子進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，每組5只試管。每組實(shí)驗(yàn)處理除相應(yīng)的單因素外，其余均采取前述標(biāo)準(zhǔn)處理?xiàng)l件。另取20只試管，分為4組，做相同單因素實(shí)驗(yàn)處理，反應(yīng)過(guò)程中輔以超聲處理對(duì)照。反應(yīng)完成后，分別測(cè)定各組吸光度值，計(jì)算羥脯氨酸含量。

1.3.5 鯽魚(yú)魚(yú)皮中膠原蛋白提取率的計(jì)算

參照李曉等[28]的方法，計(jì)算公式如下：

式中：M表示鯽魚(yú)皮中的羥脯氨酸質(zhì)量，μg；C表示單因素實(shí)驗(yàn)中上清液中羥脯氨酸的濃度， μg/mL；V表示上清液的體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

參照郭恒斌等[26]的操作步驟和方法，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖見(jiàn)圖1，標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.074 9x+0.006 2，R2=0.999 5，羥脯氨酸含量與吸光度之間的線性關(guān)系良好。

圖1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響見(jiàn)圖2。隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原蛋白提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在超聲處理60 min時(shí)達(dá)到峰值。隨著超聲時(shí)間的增加，鯽魚(yú)魚(yú)皮組織分解程度也在增加，蛋白酶與魚(yú)皮組織充分反應(yīng)，超聲處理60 min時(shí)，魚(yú)皮組織內(nèi)的膠原蛋白充分溶解釋放，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲處理時(shí)間，鯽魚(yú)皮膠原蛋白的提取效果逐漸變差。經(jīng)分析認(rèn)為，超聲作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使反應(yīng)體系中的溫度上升，從而影響酶反應(yīng)的活力，使膠原蛋白的提取率持續(xù)降低[29]。因此，膠原蛋白提取處理的最適超聲時(shí)間為60 min，提取效果最好，提取率達(dá)

圖2 超聲時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

12.97%。

2.2.2 料液比對(duì)膠原蛋白提取率的影響

料液比對(duì)膠原蛋白提取率的影響如圖3。超聲-雙酶法的提取率明顯高于雙酶法。超聲-雙酶法的膠原蛋白提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在1∶10（g∶mL）時(shí)提取率最高，此時(shí)反應(yīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，隨著料液比例的繼續(xù)增大，提取效率出現(xiàn)下降態(tài)勢(shì)，說(shuō)明反應(yīng)飽和后，繼續(xù)加料會(huì)影響酶的作用活力，其濃度也會(huì)降低，達(dá)不到最佳的反應(yīng)效果。因此，該法提取的最佳料液比例為1∶10（g∶mL），得到的提取率為14.70%。使用雙酶法進(jìn)行提取，膠原蛋白提取率也呈先上升后下降的趨勢(shì)，雙酶法提取的最佳料液比例為1∶15（g∶mL），提取率為9.52%，可能是由于沒(méi)有超聲輔助，蛋白酶與魚(yú)皮組織反應(yīng)不夠充分。

圖3 料液比對(duì)膠原蛋白提取率的影響

2.2.3 風(fēng)味蛋白酶添加量對(duì)膠原蛋白提取率的影響

風(fēng)味蛋白酶添加量對(duì)膠原蛋白提取率的影響見(jiàn)圖4。超聲-雙酶法的提取率比雙酶法高。蛋白酶加入量從2 000 U/g增加到4 000 U/g 時(shí)，2種方法的提取率總體均呈升高趨勢(shì)，加入量達(dá)到4 000 U/g時(shí)，2種方法均達(dá)到最佳提取效果，當(dāng)加入量超過(guò)4 000 U/g，提取率均持續(xù)降低。隨著風(fēng)味蛋白酶添加量的增多，反應(yīng)效率增大，當(dāng)反應(yīng)中的蛋白酶達(dá)到一定量時(shí)，反應(yīng)的速率不再變化，說(shuō)明反應(yīng)已經(jīng)充分，繼續(xù)添加蛋白酶會(huì)對(duì)提取效率產(chǎn)生抑制作用[29]。因此，2種方法的風(fēng)味蛋白酶最適加入量都為4 000 U/g，提取率分別為11.33%（超聲-雙酶法）和10.29%（雙 酶法）。

圖4 風(fēng)味蛋白酶添加量對(duì)膠原蛋白提取率的影響

2.2.4 堿性蛋白酶添加量對(duì)膠原蛋白提取率的影響

堿性蛋白酶添加量對(duì)膠原蛋白提取率的影響見(jiàn)圖5。超聲-雙酶法的提取率明顯高于雙酶法。堿性蛋白酶加入量由2 000 U/g增加到6 000 U/g 時(shí)，2種方法的提取率總體均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。蛋白酶加入量達(dá)到4 000 U/g時(shí)，達(dá)到最佳提取效果，提取率分別為12.27%（超聲-雙酶法）和9.77%（雙酶法）。反應(yīng)過(guò)程中，蛋白酶的添加量逐漸增多，反應(yīng)效率也會(huì)增大，當(dāng)反應(yīng)中的蛋白酶達(dá)到一定量時(shí)，反應(yīng)的速率不再變化，說(shuō)明反應(yīng)已經(jīng)充分。再繼續(xù)添加蛋白酶，產(chǎn)物的量會(huì)增大，會(huì)對(duì)提取效率產(chǎn)生抑制作用[29]。

圖5 堿性蛋白酶添加量對(duì)膠原蛋白提取率的影響

2.2.5 酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響見(jiàn)圖6。超聲-雙酶法的提取效率明顯比雙酶法高。超聲-雙酶法在45 ℃的提取效果最佳，45 ℃后提取率呈下降態(tài)勢(shì)。雙酶法的最佳提取溫度為50 ℃，繼續(xù)升高提取溫度，提取率降低。蛋白酶的活力隨反應(yīng)溫度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到最佳反應(yīng)溫度時(shí)，蛋白酶與鯽魚(yú)皮組織反應(yīng)最充分，提取效果最佳，繼續(xù)升高反應(yīng)溫度，蛋白酶的活力下降，提取率也下降。反應(yīng)中以超聲進(jìn)行輔助，反應(yīng)物破碎程度更大，與蛋白酶接觸更充分[20]。因此，超聲-雙酶法在45 ℃時(shí)達(dá)到最大提取率，為12.13%，雙酶法在50 ℃時(shí)達(dá)到最大提取率，為10.53%。

圖6 酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

3 結(jié)論與討論

單因素實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，雙酶法對(duì)鯽魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白的最佳提取條件分別為料液比1∶15（g∶mL）、風(fēng)味蛋白酶添加量4 000 U/g、堿性蛋白酶添加量 4 000 U/g、酶解溫度50 ℃，提取率分別為9.52%、10.29%、9.77%和10.53%；超聲-雙酶法的最佳提取條件料液比1∶10、風(fēng)味蛋白酶添加量4 000 U/g、堿性蛋白酶添加量4 000 U/g、酶解溫度45 ℃，提取率分別為14.70%、11.33%、12.27%和12.13%。超聲-雙酶法對(duì)鯽魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白的最大提取效率均大于雙酶法，對(duì)鯽魚(yú)皮膠原蛋白提取的優(yōu)化作用明顯，尤其是在相同料液比、酶解溫度條件下，超聲-雙酶法提取率明顯高于雙酶法。因此，超聲-雙酶法在提取鯽魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白時(shí)，有利于降低料液比和酶解溫度，效果更好，效率更高，對(duì)鯽魚(yú)皮的利用也更充分。此結(jié)論和王錫念等[30]用相似方法提取鮟鱇魚(yú)皮膠原蛋白的結(jié)論一致，具有一定的參考性。