白海娜

（吉林化工學(xué)院，吉林吉林 132022）

雙孢菇也被稱為圓蘑菇、白蘑菇或者洋蘑菇，為低溫性的菇類，因同時(shí)生長(zhǎng)出兩個(gè)孢子而被命名。雙孢菇是目前世界范圍內(nèi)栽培規(guī)模最大、總產(chǎn)量最大、單位栽培面積產(chǎn)量最高、栽培技術(shù)現(xiàn)代化程度最高的食用菌種，也是我國(guó)目前栽培最廣泛、產(chǎn)量最大的食用菌種。真菌是營(yíng)養(yǎng)成分較為豐富的物質(zhì)，一直深受人們的喜愛(ài)。真菌多糖能夠增強(qiáng)人體的免疫功能、延緩衰老、抗癌、美容，因此受到人們的一致好評(píng)，具有較為廣闊的市場(chǎng)發(fā)展前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：市售雙孢菇，烘干粉碎，過(guò)80目篩，備用。試劑：糖樣品、蒸餾水、氯化鈉溶液、氫氧化鈉溶液、濃硫酸和重蒸酚。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100型高速粉碎機(jī)、TGL-16C型離心機(jī)、WD800G型微波爐、HH-4型恒溫水浴鍋、AR1530/C型電子天平、RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DS型循環(huán)水式真空泵、TU-1810DS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、冷凍干燥機(jī)及離子交換柱、變色硅膠干燥器、容量瓶、燒杯、比色管和通風(fēng)櫥等[4]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

（1）多糖提取。雙孢菇干粉適量，按照料液比均勻混合，進(jìn)行微波輔助水浴法處理，微波功率設(shè)置為560 W，提取液上離心機(jī)以4 000 r/min為條件離心15 min，對(duì)上清液多糖含量進(jìn)行測(cè)定[1]。濃縮上清液后加入濃縮液3倍體積的C2H5O（乙醇）溶液，常溫條件下析出棕色絮狀的粗多糖，上離心機(jī)以 4 000 r/min為條件離心15 min，收集沉淀，冷凍干燥后得到粗多糖。

（2）多糖含量測(cè)定。取2 g雙孢菇多糖，按照上述提取實(shí)驗(yàn)操作提取雙孢菇多糖提取液，取上清液0.5 mL，分別加入5%的苯酚溶液1 mL、濃硫酸 5 mL，搖勻后置于40 ℃的水浴中，經(jīng)過(guò)30 min的加熱和10 min的冷卻，測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處的吸光度，采用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式來(lái)計(jì)算提取液中的多糖含量[2]。計(jì)算公式為：

式中：m1為多糖的質(zhì)量，g；m2為雙孢菇的干粉質(zhì)量，g。

（3）單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。取雙孢菇樣品，磨成粉末并按照不同配比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40）（1∶50和1∶60）制成料液，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。本次實(shí)驗(yàn)共測(cè)定不同料液比、微波時(shí)間、提取時(shí)間對(duì)雙孢菇多糖得率的影響。

1.3.2 雙孢菇多糖分離純化

（1）DEAE Sephadex A-25分 離 純 化。DEAE Sephadex A-25經(jīng)預(yù)處理后裝柱，取適量多糖樣品放入容器，并加入蒸餾水，配成4 mg/mL多糖溶液，取3 mL上柱。收集洗脫液共160管，每管5 mL，其中蒸餾水40管、氯化鈉溶液（0.1 mol/L）40管、氯化鈉溶液（0.3 mol/L）40管、氫氧化鈉溶液（0.1 mol/L）40管。并利用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖吸光值[5]。

（2）多糖純度測(cè)定。①紫外光譜掃描。取適量多糖樣品制成水溶液，并在200～400 nm下進(jìn)行掃描。②多糖純度鑒定。將洗脫后的多糖溶液稀釋成2 mg/mL溶液，取2 mL上Sephadex G-200柱，以氯化鈉溶液（0.1 mol/L）為流動(dòng)相，流速每分鐘 0.5 mL，對(duì)多糖純度進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素分析

2.1.1 微波時(shí)間對(duì)雙孢菇多糖得率的影響

取相同配比料液6份，以相同功率進(jìn)行超聲處理，時(shí)間分為為10 s、20 s、30 s、40 s、50 s和60 s，并在相同溫度下提取相同時(shí)間后，經(jīng)離心處理后提取6份上清液，測(cè)定多糖得率結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，多糖得率隨著微波時(shí)間的增加而先升后降。微波時(shí)間處于40 s時(shí)能夠獲得最多的多糖，隨著時(shí)間的增加，雙孢菇的細(xì)胞會(huì)加劇破碎，釋放更多的多糖。

圖1 微波時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

2.1.2 料液比對(duì)雙孢菇多糖得率的影響

取不同配比料液共6份，料液比（g/mL）分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60。所有料液以相同功率進(jìn)行相同時(shí)間的超聲處理，并在相同溫度下提取相同時(shí)間后，經(jīng)離心處理后提取6份上清液，測(cè)定多糖得率結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，多糖得率隨著溶劑的用量增多而出現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。料液比在1∶40（g/mL）時(shí)能夠獲得最多的多糖。料液比過(guò)大會(huì)導(dǎo)致體系的流動(dòng)性降低，無(wú)法進(jìn)行多糖提取。料液比過(guò)小會(huì)降低體系的反應(yīng)速率[3]。因此最佳料液比是1∶40（g/mL）。

圖2 料液比對(duì)多糖得率的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)雙孢菇多糖得率的影響

取相同配比料液6份，以相同功率進(jìn)行相同時(shí)間的超聲處理，并在同一提取溫度下分別提取1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h和4 h后，經(jīng)離心處理后提取6份上清液，測(cè)定多糖得率結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，多糖得率隨著提取時(shí)間的增加而先增后減。提取時(shí)間在3 h時(shí)能夠獲得的多糖最多。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

2.2 雙孢菇多糖的分離純化

2.2.1 DEAE-Sephadex A-25柱層析純化

通過(guò)DEAE-Sephadex A-25對(duì)雙孢菇多糖溶液樣品進(jìn)行分離純化，并利用自動(dòng)收集器分部收集，采用苯酚-硫酸法對(duì)所有樣品進(jìn)行逐一檢測(cè)，洗脫結(jié)果如圖4所示。

圖4 雙孢菇多糖DEAEDEAE-SephadexA-25柱層析洗脫曲線

由圖4可知，利用蒸餾水、氯化鈉溶液 （0.1 mol/L）、氯化鈉溶液（0.3 mol/L）和氫氧化鈉溶液（0.1 mol/L）洗脫過(guò)程中，均存在吸收峰值，且相較于氫氧化鈉溶液（0.1 mol/L）、氯化鈉溶液 （0.3 mol/L），蒸餾水、氯化鈉溶液（0.1 mol/L）洗脫物質(zhì)量更大。因此，本研究以這兩組樣品為主要研究對(duì)象，將這兩個(gè)洗脫組分分別收集，并進(jìn)行醇沉處理，最后通過(guò)離心沉淀及冷凍干燥處理，得到兩種產(chǎn)物：①A-25-1為淡黃色粉末；②A-25-2為淺褐色粉末。

2.2.2 雙孢菇菇柄多糖純度鑒定

取A-25-1、A-25-2樣品各10 mg，分別融于含10 mL蒸餾水的容器中，并將其置于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)下進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖5所示。

圖5 A-25-1、A-25-2紫外可見(jiàn)光掃描結(jié)果

由圖5可知，在260 nm、280 nm處，A-25-1、A-25-2紫外掃描均為發(fā)現(xiàn)峰值，這表明雙孢菇多糖經(jīng)分離純化后已沒(méi)有蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)。

3 結(jié)論

（1）本次研究以微波輔助水浴法進(jìn)行雙孢菇多糖提取實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)測(cè)定了料液比、微波時(shí)間、提取時(shí)間對(duì)雙孢菇多糖提取的影響，結(jié)果表明雙孢菇多糖最佳提取時(shí)間為3 h，最佳料液比為1∶40，最佳微波時(shí)間為40 s。

（2）雙孢菇多糖經(jīng)DEAE-SephadexA-25柱層析純化后，蒸餾水、氯化鈉溶液（0.1 mol/L）洗脫物質(zhì)量更大，且利用紫外光掃描后發(fā)現(xiàn)并無(wú)蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)。