張影，徐穎華，江霞云，魯旭，楊蕾，於洋，王斌，趙愛華，李麗莉

過敏性疾病是由變應(yīng)原引起的全球性高發(fā)病，其臨床癥狀包括過敏性結(jié)膜炎、鼻炎、哮喘和皮炎等[1]，不僅降低了人們的生活質(zhì)量，也耗費(fèi)了大量的醫(yī)療資源[1-2]。20世紀(jì)70年代以來，過敏性疾病的發(fā)病率持續(xù)上升，全世界患過敏性疾病的人口數(shù)約占15%～30%[2]。塵螨(House Dust Mite, HDM)作為最主要引起易感人群過敏的環(huán)境變應(yīng)原之一，可導(dǎo)致多種過敏性疾病,包括過敏性哮喘[3-4]。

迄今為止，過敏性疾病的發(fā)病機(jī)制及脫敏治療的免疫耐受機(jī)制尚不完全清楚，而受包括倫理在內(nèi)等因素限制，直接在患者體內(nèi)進(jìn)行相關(guān)研究還存在困難，因而建立變應(yīng)原特異性過敏動物模型對于變應(yīng)原的致敏機(jī)制探索、變應(yīng)原制品開發(fā)及質(zhì)量評價具有重要意義。小鼠過敏模型因具有與人類過敏反應(yīng)相似的病理生理學(xué)特征，以及具有豐富的高質(zhì)量免疫學(xué)檢測試劑，目前常被用于變應(yīng)原致敏機(jī)制研究。屋塵螨變應(yīng)原提取物的蛋白組分非常復(fù)雜，其中相對分子質(zhì)量為36 078.4的第1組變應(yīng)原(Der.p1)被認(rèn)為是屋塵螨變應(yīng)原提取物中最重要的過敏蛋白[5-6]，但文獻(xiàn)報(bào)道所建立的塵螨變應(yīng)原致敏小鼠模型均以變應(yīng)原提取液的總蛋白定量，Der.p1在過敏動物模型的建立是否起關(guān)鍵作用，尚未見報(bào)道[7-10]。不同生產(chǎn)廠家的變應(yīng)原提取物的蛋白組成差異非常大，利用這些組分差異較大的屋塵螨抗原所建立的動物模型間是否具有可比性，也未見研究報(bào)道。

Der.p1是屋塵螨變應(yīng)原提取物中的關(guān)鍵成分，本研究目的旨在探索Der.p1劑量與屋塵螨過敏動物模型建立效果之間的關(guān)系。依據(jù)屋塵螨變應(yīng)原提取物中Der.p1的含量設(shè)置免疫劑量、免疫次數(shù)，比較不同免疫程序?qū)^敏小鼠模型建立效果的影響，并進(jìn)一步比較不同來源屋塵螨變應(yīng)原提取物對過敏動物模型建立效果的影響，為深入研究變應(yīng)原的致敏機(jī)制及屋塵螨變應(yīng)原特異性免疫治療制劑臨床前藥理藥效評價體系的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器試劑

ELISA酶標(biāo)儀Spectra MaxI3，Molecular Devices公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 Guava eastCyte8HT，密理博公司產(chǎn)品；酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀 Analyzer3，Thermo公司產(chǎn)品；6孔自動洗板機(jī)Wellwash Versa，Thermo公司產(chǎn)品。恒溫培養(yǎng)箱RCO3000T，Thermo公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞分析儀FACSCantoⅡ，BD公司產(chǎn)品。

屋塵螨變應(yīng)原提取物A～C分別來自浙江我武生物科技股份有限公司、法國Stallergenes Greer公司、德國Allergopharma公司，上述3種提取物的總蛋白含量分別為為7.7、33.5、1.0 mg/mL，1組主要變應(yīng)原(Der.p1)含量分別為17.0、11.5、32.0 μg/mL。Al(OH)3佐劑購自InvivoGen公司；HRP(horse radish peroxiduse,辣根過氧化物酶)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgE、IgG1、IgG2a購自Southern Biotech公司；HRP標(biāo)記的小鼠IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ ELISPOT試劑盒購自Mabtech公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；Albumin Bovine V、雙抗購自索萊寶公司；FBS購自GIBCO公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自HyClone公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 屋塵螨變應(yīng)原致敏小鼠模型建立

SPF級BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡，購自中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物資源研究所，動物生產(chǎn)許可證：SYXK(京)2017-0005。所有動物實(shí)驗(yàn)和處理程序均由中國食品藥品檢定研究院動物倫理委員會批準(zhǔn)。首先利用抗原進(jìn)行致敏小鼠模型建立，實(shí)驗(yàn)分組及免疫程序見表1。3-20、3-100、3-200、3-500組于第0、7和14天皮下注射以Der.p1計(jì)不同濃度的A企業(yè)屋塵螨變應(yīng)原提取物溶液100 μL；2-20、2-100、2-200、2-500組于第7和14天皮下注射以Der.p1計(jì)不同濃度的A企業(yè)屋塵螨變應(yīng)原提取物溶液100 μL；1-20、1-100、1-200、1-500組于第14天皮下注射以Der.p1計(jì)不同濃度的A企業(yè)屋塵螨變應(yīng)原提取物溶液100 μL。對照組設(shè)為3組，其中卵清蛋白(ovalbumin,OVA)免疫對照組于第0、7和14天皮下注射抗原濃度為20 μg/mL的OVA溶液100 μL；陰性對照組和空白激發(fā)組(屋塵螨抗原滴鼻激發(fā)組)于第0、7和14天皮下注射100 μL的生理鹽水。致敏結(jié)束后，停息一周，從第22天開始所有實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M、OVA免疫組和空白激發(fā)組每天給予20 μL屋塵螨變應(yīng)原提取物(Der.p1濃度為500 μg/mL)滴鼻激發(fā)，持續(xù)7 d；陰性對照組滴鼻20 μL生理鹽水。

表1 實(shí)驗(yàn)動物分組Table 1 Group of experimental animals

1.2.2 體征觀察和評分

每只小鼠滴鼻激發(fā)后，仔細(xì)觀察并記錄小鼠30 min內(nèi)搔鼻、噴嚏次數(shù)和鼻分泌物量。小鼠體征評分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[10]，采用疊加量化計(jì)分法計(jì)分。

1.2.3 病理組織學(xué)觀察

末次激發(fā)24 h，分離各組小鼠的鼻黏膜組織和肺組織，并用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行浸泡固定，置4 ℃環(huán)境過夜，石蠟包埋，進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，厚度約4 μm，用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠鼻黏膜組織嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)等炎性細(xì)胞浸潤和肺組織淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、水腫及支氣管上皮損傷情況(NIKON CI-S，Nikon，Tokyo，Japan)。

1.2.4 細(xì)胞免疫學(xué)水平檢測

1.2.4.1 ELISPOT檢測IL-4和IFN-γ特異性淋巴細(xì)胞數(shù)量：末次激發(fā)后24 h，無菌條件下分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，調(diào)整脾細(xì)胞濃度為2.5×106/mL，取出預(yù)包被IL-4和IFN-γ的檢測用ELISPOT 96孔板，用無菌PBS洗5遍，200 μL/孔。加入含10% FBS的1640培養(yǎng)基，200 μL/孔，室溫封閉至少30 min。棄培養(yǎng)基，依次向96孔板中加入細(xì)胞懸液100 μL/孔，Der.p1濃度為6 μg/mL的刺激物50 μL/孔。陰性對照孔：加入細(xì)胞懸液100 μL/孔，然后立即加入含10% FBS的1640培養(yǎng)基50 μL/孔；陽性對照孔：加入細(xì)胞懸液100 μL/孔，然后立即加入含ConA 1 μg/mL的陽性對照刺激物50 μL/孔，均做復(fù)孔。將96孔板置于5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12～48 h。棄掉細(xì)胞懸液，用PBS洗板5遍，200 μL/孔。用含0.5% FBS的PBS將檢測抗體稀釋至1 μg/mL，加入96孔板，100 μL/孔，室溫孵育2 h。棄抗體溶液，用PBS洗板5遍，200μL/孔。用含0.5% FBS的PBS將HRP按1∶1 000稀釋后加入96孔板，100 μL/孔，室溫孵育1 h。棄HRP溶液，用PBS洗板5遍，200 μL/孔。加入TMB底物，100 μL/孔，顯色至出現(xiàn)可區(qū)分的斑點(diǎn)。用去離子水沖洗以終止顯色反應(yīng)。自然風(fēng)干后用ELISPOT讀板儀計(jì)數(shù)。

1.2.4.2 流式細(xì)胞儀分析Th1和Th2細(xì)胞：在無菌條件下分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，調(diào)整脾細(xì)胞濃度為1.0×106/mL，各管加入1.0×106個細(xì)胞在100 μL stain buffer反應(yīng)體系內(nèi)。各管加入適量熒光標(biāo)記單克隆抗體：APC/FireTM750 anti-mouse CD3、FITC anti-mouse CD4、PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD183 (CXCR3)、Brilliant Violet 421TManti-mouse CD194 (CCR4)、FITC anti-mouse Lineage Cocktail with Isotype Ctrl、APC/FireTM750 anti-mouse CD45、PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD90.2 (Thy1.2)。使用FACS Calibur和FACS Canto Ⅱ系統(tǒng)分析樣品。

1.2.5 ELISA檢測血清抗體水平

對滴鼻激發(fā)前和滴鼻激發(fā)后24 h小鼠血清樣本進(jìn)行特異性IgE、IgG1、IgG2a抗體檢測，方法如下: 屋塵螨抗原用pH 9.6碳酸鹽緩沖液稀釋成20 μg/mL的包被濃度，以100 μL/孔包被ELSIA板，4 ℃過夜。封閉后加入1∶50稀釋的上述血清，37 ℃孵育1 h。依次加入1∶4 000稀釋的特異性山羊抗小鼠二抗，用TMB顯色測定血清樣本的吸光度(A)值。滴鼻激發(fā)后的血樣進(jìn)行總IgE抗體水平檢測，操作方法參見市售小鼠IgE檢測試劑盒(Bethyl，State of Texas，USA)。

1.2.6 屋塵螨變應(yīng)原致敏小鼠模型重復(fù)驗(yàn)證

分別利用屋塵螨變應(yīng)原A～C進(jìn)行屋塵螨致敏小鼠模型的構(gòu)建，免疫抗原劑量參見表1中2-100組致敏程序，陰性對照組用生理鹽水致敏，具體方法參見1.2.1。致敏后的小鼠通過癥狀觀察、ELISPOT、Th1/Th2比值分析、血清特異性IgE抗體水平變化等指標(biāo)變化(相關(guān)操作分別參見1.2.2、1.2.4、1.2.5)，驗(yàn)證致敏模型過敏反應(yīng)和免疫學(xué)評價的可重復(fù)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的組間比較采用單因素方差分析；不滿足正態(tài)分布和方差齊的數(shù)據(jù)，采用多組比較的非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體征評分結(jié)果

各組小鼠屋塵螨變應(yīng)原致敏后體外癥狀評分結(jié)果顯示除空白激發(fā)組外所有模型組與陰性對照組相比均具有顯著性差異(0.000 1≤P≤0.011)，致敏成功；以Der.p1濃度為100 μg/mL的抗原免疫2針組(2-100組)與2-200、2-500、3-100、3-200、3-500等組比較癥狀無顯著差異(0.099≤P≤1.00 0)，但癥狀評分高于其他模型組(0.000 1≤P≤0.039)。OVA免疫組小鼠經(jīng)屋塵螨抗原滴鼻后的癥狀評分雖與陰性對照組有差異(P=0.01 1)，但評分低于各屋塵螨過敏模型組(表2)。表明本研究所建立的屋塵螨致敏小鼠模型具有較好的抗原特異性。

表2 屋塵螨抗原激發(fā)后各組小鼠癥狀評分Table 2 Comparison scores of in vitro after excitation of dust mite allergens(n=6)

2.2 病理組織學(xué)變化

2.2.1 小鼠鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)變化

正常組小鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，纖毛完整，黏膜下層缺少炎性細(xì)胞積聚，鼻腔黏膜的腺體增生不明顯。OVA組(OVA免疫、屋塵螨抗原滴鼻激發(fā))、空白激發(fā)組(用生理鹽水進(jìn)行皮下注射免疫，僅用屋塵螨變應(yīng)原進(jìn)行滴鼻激發(fā)7 d)和屋塵螨抗原免疫1針模型組小鼠鼻黏膜均無顯著炎性癥狀。免疫2針模型組中2-100、2-200組和免疫3針模型組中3-100、3-200組小鼠鼻黏膜可見少量黏膜上皮脫失，黏膜下可見較多淋巴細(xì)胞，吞噬細(xì)胞浸潤，鼻腔可見炎性滲出物，過敏炎癥程度較明顯。免疫2針模型組中2-20組鼻腔中有少量黏膜脫落，2-500組有少量黏膜細(xì)胞脫落和炎性細(xì)胞浸潤。免疫3針模型組中 3-20和3-500組有少量黏膜細(xì)胞脫落(圖1)。

圖 1 各組過敏小鼠鼻黏膜病理形態(tài)學(xué)(HE staining，×40)(n=6)

2.2.2 小鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化

正常組小鼠肺組織支氣管管腔光滑、上皮完整、氣道黏膜無水腫，肺泡間隔正常。OVA組、空白激發(fā)組和屋塵螨抗原免疫1針模型組小鼠肺組織均無顯著炎性癥狀。免疫2針模型組中2-100、2-200和免疫3針模型組中3-100組小鼠細(xì)支氣管周圍炎細(xì)胞浸潤，可見嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞；細(xì)支氣管黏膜纖毛柱狀上皮有脫落，管腔內(nèi)可見黏液滲出物。其他免疫2針和免疫3針組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常(圖2)。

圖 2 各組致敏小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)(HE staining，×40)(n=6)

2.3 細(xì)胞免疫學(xué)水平檢測結(jié)果

采用ELISPOT技術(shù)檢測末次滴鼻激發(fā)24 h后小鼠脾淋巴細(xì)胞的變化，結(jié)果顯示經(jīng)含Der.p1 2 μg/mL屋塵螨抗原刺激后，除1-20致敏組外，其余各模型組小鼠脾細(xì)胞分泌抗原特異性IL-4淋巴細(xì)胞數(shù)量與對照組比較均顯著增加(0.011≤P≤0.046)，其中2-100組與2-200組小鼠脾細(xì)胞中抗原特異性IL-4增長最顯著(P分別為0.011和0.014)，但這兩者組間比較差異無顯著性(P=1.000)。單純用屋塵螨抗原激發(fā)的空白激發(fā)組及OVA免疫而屋塵螨滴鼻激發(fā)的OVA組與陰性對照組比較，屋塵螨抗原特異性IL-4淋巴細(xì)胞均未出現(xiàn)顯著增高(P值分別為0.497和0.312)(圖3A)。實(shí)驗(yàn)組小鼠脾組織淋巴細(xì)胞在Der.p1抗原刺激下未檢測到特異性IFN-γ淋巴細(xì)胞顯著升高(圖3B)。

進(jìn)一步利用流式細(xì)胞術(shù)檢測屋塵螨變應(yīng)原致敏小鼠脾淋巴細(xì)胞的Th1/Th2細(xì)胞分型，結(jié)果顯示免疫3針模型組小鼠與陰性對照組比較脾組織中淋巴細(xì)胞明顯向Th2型細(xì)胞極化，Th1/Th2細(xì)胞比例降低最顯著(P=0.01)；免疫2針模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞與陰性對照組比較也出現(xiàn)淋巴細(xì)胞向Th2型的極化(0.012≤P≤0.047)；免疫1針模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞與陰性對照組比較未出現(xiàn)向Th2型淋巴細(xì)胞的明顯極化(圖3C)(0.961≤P≤1.000)。

圖 3 致敏小鼠細(xì)胞免疫水平(n=6)Fig 3 Cellular immunity level in allergic mice(n=6)A:致敏小鼠抗原特異性IL-4型淋巴細(xì)胞檢測結(jié)果；B：致敏小鼠抗原特異性IFN-γ淋巴細(xì)胞檢測結(jié)果；C：致敏小鼠CXCR3+%/CCR4+%(Th1/Th2)淋巴細(xì)胞分型檢測結(jié)果;IL-4：抗原特異性IL-4型淋巴細(xì)胞；INF-γ：抗原特異性γ干擾素型細(xì)胞；CXCR3+/CCR4+(Th1/Th2)：Th1型免疫細(xì)胞與Th2型免疫細(xì)胞比值；Control：對照；OVA：卵清蛋白；Blank excitation:空白激發(fā);模型組與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；實(shí)驗(yàn)組與2-100組比較，#P<0.05

2.4 體液免疫水平檢測結(jié)果

應(yīng)用ELISA法檢測各組小鼠激發(fā)前與激發(fā)后血清中Der.p1特異性IgE、IgG1與IgG2a抗體水平和激發(fā)后小鼠的總IgE水平。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)2-100、2-200、3-20和3-100四組小鼠經(jīng)屋塵螨抗原激發(fā)后血清中特異性IgE增長顯著，與激發(fā)前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.00017、0.003、0.01、0.01)(圖4A)。2-200組模型小鼠的總IgE值與2-100、2-500、3-20、3-100組無顯著差異(P>0.05)，但顯著大于其他實(shí)驗(yàn)組(圖4B)(0.004≤P≤0.045)。此外，除1-20和1-100兩個實(shí)驗(yàn)組外，其余實(shí)驗(yàn)組激發(fā)前與激發(fā)后的IgG1的OD值均有顯著性差異，其中2-100、2-500組和3-500組的增長顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(圖4C)(P值分別為0.01、0.008、0.008)，但這3組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各模型組激發(fā)前后的IgG2a的OD值變化差異不大，與陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖 4 致敏小鼠體液免疫水平(n=6)Fig 4 Humoral immunity level in allergic mice(n=6)A：致敏小鼠血清抗原特異IgE檢測結(jié)果；B：致敏小鼠血清抗總IgE檢測結(jié)果；C：致敏小鼠血清抗原特異IgG1檢測結(jié)果；Blank excitation:空白激發(fā)；OVA：卵清蛋白；Control：對照；IgE：抗原特異性IgE抗體；Total IgE：總IgE抗體；IgG1：抗原特異性IgG1抗體；Senstized：致敏組；Challernged：抗原激發(fā)組;激發(fā)前與激發(fā)后比較，*P<0.05，**P<0.01; 實(shí)驗(yàn)組與2-200組比較，aP<0.05，aaP<0.01

2.5 屋塵螨致敏小鼠鼻炎模型建立方法的可重復(fù)性

在前期模型優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇3種不同來源的屋塵螨變應(yīng)原提取物，依據(jù)Der.p1濃度，選擇2-100致敏程序進(jìn)行致敏小鼠模型的建立，進(jìn)一步觀察不同來源蛋白致敏后小鼠的癥狀評分、IL-4特異性淋巴細(xì)胞變化、血清特異性IgE抗體水平變化、Th1/Th2細(xì)胞分型。結(jié)果表明雖然不同來源的屋塵螨提取物蛋白組分差異較大，但依據(jù)Der.p1含量進(jìn)行過敏小鼠模型建立，所建立致敏小鼠模型的各項(xiàng)評價指標(biāo)基本一致，3種不同來源屋塵螨變應(yīng)原致敏小鼠的體外特征評分結(jié)果基本一致(圖5A)，且與陰性對照組相比均有顯著性差異(P值分別為0.003、0.003、0.002)；3種不同來源屋塵螨變應(yīng)原致敏后小鼠脾淋巴細(xì)胞抗原特異性IL-4數(shù)量與陰性對照組相比均增加(P值分別為0.002、0.005、0.005)(圖5B)；ELISA數(shù)據(jù)顯示各實(shí)驗(yàn)組血清特異性IgE水平基本一致，與陰性對照組相比具有顯著性差異(P值分別為0.004、0.003、0.003)(圖5C)；流式細(xì)胞結(jié)果分析各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾組織中Th1/Th2細(xì)胞比例出現(xiàn)嚴(yán)重失衡現(xiàn)象，偏向Th2型細(xì)胞，極化程度較陰性對照組顯著降低(P值分別為0.02、0.03、0.03)(圖5D)。

圖 5 3種不同來源屋塵螨抗原所建立致敏小鼠的過敏反應(yīng)及免疫學(xué)評價比較(n=6)

3 討論

過敏性疾病已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，其流行程度呈逐年上升趨勢。采用變應(yīng)原制劑進(jìn)行特異性免疫治療是過敏性疾病的唯一對因治療方式，但迄今為止，過敏性疾病的發(fā)病機(jī)制和免疫治療的耐受機(jī)制均不清楚，且尚未建立有效的療效評價用生物標(biāo)記物等現(xiàn)狀嚴(yán)重阻礙了特異性免疫治療制劑的開發(fā)。建立適宜的致敏動物模型對于變應(yīng)原的致敏機(jī)制的探索以及變應(yīng)原制品的臨床前評價研究具有重要意義。

塵螨變應(yīng)原是最重要的一類環(huán)境變應(yīng)原，在亞洲、歐洲、北美等人口稠密地區(qū)，高達(dá)85%的哮喘患者對屋塵螨過敏[4]。塵螨變應(yīng)原組分復(fù)雜，目前已至少鑒定出34種具有致敏活性的變應(yīng)原蛋白，其中Der.p1是目前公認(rèn)的引起人體過敏性疾病的最重要的變應(yīng)原組分[5-6,11-12]。迄今為止，塵螨變應(yīng)原類制品均是以純化的螨蟲培養(yǎng)物為原材料制備而成，除了上述Der.p1主要變應(yīng)原外還含有很多其他的非致敏蛋白，不同企業(yè)制備的屋塵螨變應(yīng)原提取物抗原組成差異非常大[5,13-15]，為了加強(qiáng)對這類制品的質(zhì)量控制，歐洲及中國的藥典都將Der.p1的含量作為屋塵螨變應(yīng)原體內(nèi)診斷制劑及脫敏治療制劑質(zhì)量控制的一項(xiàng)關(guān)鍵參數(shù)[16-17]。但是目前文獻(xiàn)報(bào)道的屋塵螨過敏小鼠模型都沒有說明關(guān)鍵變應(yīng)原活性組分與致敏癥狀之間的關(guān)系[10,18]。本研究探索主要變應(yīng)原Der.p1在過敏小鼠模型建立中的作用，觀察到屋塵螨1組主要變應(yīng)原劑量與致敏效果間的量效關(guān)系，Der.p1的劑量是屋塵螨過敏小鼠模型建立的重要影響因素，以Der.p1含量為100～200 μg/mL的屋塵螨變應(yīng)原皮下注射免疫BALB/c小鼠，注射體積為0.1 mL/小鼠，免疫2～3次，并以Der.p1含量為10 μg的屋塵螨抗原滴鼻激發(fā)，小鼠的過敏癥狀評分、病理結(jié)果、特異性IgE、總IgE、抗原特異性IL-4型淋巴細(xì)胞等變化均比較顯著。病理檢測結(jié)果顯示本研究采用的致敏程序均能使過敏小鼠產(chǎn)生較明顯鼻部炎性反應(yīng)，其中2-100、2-200和3-100三組動物的過敏性鼻炎癥狀尤為顯著，而這3組動物的肺部也有明顯的炎性細(xì)胞浸潤，由此推測重度過敏性鼻炎存在可發(fā)展成肺部炎性反應(yīng)的可能性，但本研究尚未對實(shí)驗(yàn)小鼠開展深入的過敏性哮喘病理特征的評價，未來研究還需要進(jìn)一步探索建立過敏性哮喘動物模型的最佳致敏程序。鑒于免疫2針的2-100組經(jīng)抗原激發(fā)后特異性IgE與抗原滴鼻激發(fā)前比較升高最顯著，本研究進(jìn)一步依據(jù)Der.p1劑量，采用2-100組免疫程序，利用總蛋白含量差異較大的3種不同來源屋塵螨變應(yīng)原提取物進(jìn)行屋塵螨過敏小鼠模型的建立，所建立的屋塵螨過敏小鼠模型具有較好的可重現(xiàn)性。

已報(bào)道的過敏小鼠模型建立方法較多，包括直接利用抗原滴鼻激發(fā)進(jìn)行過敏模型建立[19]，以及采用皮下或腹腔注射免疫與變應(yīng)原滴鼻激發(fā)相結(jié)合的方式進(jìn)行過敏小鼠模型建立[20]。本研究發(fā)現(xiàn)皮下注射免疫與滴鼻激發(fā)相結(jié)合的方法僅需要3周時間即可成功建立過敏小鼠模型，過敏小鼠不僅產(chǎn)生明顯的生理和病理反應(yīng)，特異性IgE抗體水平和抗原特異性IL-4型淋巴細(xì)胞水平也均顯著高于單純屋塵螨抗原滴鼻激發(fā)組小鼠。

在過敏性疾病的發(fā)生過程中CD4+T細(xì)胞起重要作用。CD4+T細(xì)胞在抗原刺激下可以分化成兩個亞群，即Th1和Th2，正常情況下，Th1和Th2型細(xì)胞處于相對平衡狀態(tài)。過敏性疾病存在Th1/Th2向Th2細(xì)胞免疫偏移，Th2型免疫反應(yīng)過強(qiáng)[21-24]。本研究發(fā)現(xiàn)屋塵螨致敏后小鼠出現(xiàn)不同程度的Th1/Th2比值下降，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。值得注意的是屋塵螨變應(yīng)原免疫3針的各組小鼠Th1/Th2失衡嚴(yán)重程度高于免疫1針的各組小鼠，同時OVA免疫3針小鼠的Th1/Th2比值也出現(xiàn)嚴(yán)重失衡，提示變應(yīng)原具有導(dǎo)致機(jī)體免疫反應(yīng)偏向Th2發(fā)展的屬性，采用變應(yīng)原進(jìn)行多次皮下注射免疫可快速導(dǎo)致Th1/Th2失衡，是建立變應(yīng)原致敏小鼠模型的一個重要程序。

本研究通過ELISPOT技術(shù)檢測到屋塵螨過敏小鼠脾臟淋巴細(xì)胞在屋塵螨抗原刺激下分泌IL-4淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著升高，IFN-γ性淋巴細(xì)胞數(shù)量在過敏小鼠內(nèi)基本不能被誘導(dǎo)增生，進(jìn)一步證實(shí)過敏反應(yīng)會導(dǎo)致Th1和Th2型細(xì)胞失衡。Th2細(xì)胞被激活后會導(dǎo)致IL-4等細(xì)胞因子的分泌增加，介導(dǎo)B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞并誘導(dǎo)其產(chǎn)生IgG1和IgE[25],本研究在過敏小鼠血清中同時檢測到這兩種抗體水平的升高,與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。目前IgG4被廣泛認(rèn)為是人體內(nèi)的阻斷抗體，其抗體水平與過敏癥狀呈負(fù)相關(guān)，而小鼠IgG2a抗體被認(rèn)為是人IgG4抗體的功能等同物[26]，二者可能是人和小鼠對變應(yīng)原免疫耐受的生物標(biāo)志[27]。本研究所用的致敏程序均未導(dǎo)致IgG2a升高，因而可推測上述致敏程序?qū)е挛輭m螨過敏小鼠出現(xiàn)免疫耐受的風(fēng)險(xiǎn)均不高。本研究發(fā)現(xiàn)2-100和2-200兩個過敏組小鼠抗原特異性IL-4型淋巴細(xì)胞增生最顯著，相應(yīng)的這兩個致敏組小鼠的總IgE和特異性IgE抗體水平的升高也比較顯著，根據(jù)IL-4型淋巴細(xì)胞的變化與IgE抗體水平的一致性，初步推論利用ELISPOT技術(shù)檢測特異性IL-4淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化未作為過敏性疾病評價另一重要指標(biāo)，今后的研究需進(jìn)一步積累數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究成功建立了一種穩(wěn)定的屋塵螨變應(yīng)原致敏小鼠鼻炎模型，篩選了致敏相關(guān)的生物標(biāo)識，為進(jìn)一步研究螨變應(yīng)原制品的脫敏治療篩選有效生物考核指標(biāo)奠定了基礎(chǔ)。本研究不足之處，僅聚焦屋塵螨致敏小鼠模型中特異性IL-4和IFN-γ淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化，在后續(xù)研究中應(yīng)探索研究更多細(xì)胞活性因子在屋塵螨致敏過程中變化特征。