朱國青 李慧萍 王均波 張 穎 魯 萍 朱 葉 張凱峰 潘學霞 喬中偉 徐 秀 李冬蘊 徐 瓊

雷特綜合征(RTT; OMIM 312750)是一組主要由X染色體上的甲基化CpG結(jié)合蛋白2(MECP2)基因變異引起的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病, 呈X連鎖顯性遺傳[1, 2]。根據(jù)臨床表現(xiàn)分為典型和非典型RTT[2, 3]。典型RTT 95%由MECP2基因變異引起，而非典型RTT主要與CDKL5基因(OMIM*300203) 和FOXG1基因(OMIM*164874)變異有關(guān)[4, 5]。MR近年來越來越多地被應用于發(fā)育障礙疾病神經(jīng)機制研究中，是活體無創(chuàng)性研究大腦結(jié)構(gòu)及功能的主要手段。既往結(jié)構(gòu)MR研究發(fā)現(xiàn)RTT患者大腦灰質(zhì)及白質(zhì)均存在全局性及區(qū)域性的異常[6, 7]，說明大腦灰質(zhì)及白質(zhì)的結(jié)構(gòu)對于解釋RTT臨床特征及發(fā)病機制具有重要意義[8, 9]。本文基于典型RTT探討RTT嚴重度量表(RSSS)[13]與Griffiths精神發(fā)育量表-中文版(GDS-C)[14]、兒童睡眠習慣問卷(CSHQ)[15]和結(jié)構(gòu)MR相關(guān)性，以期為RTT的神經(jīng)病理學發(fā)病基礎(chǔ)提供線索，對于RTT診療及遠期預后具有一定的指導意義。

1 方法

1.1 研究設(shè)計 橫斷面調(diào)查的相關(guān)性分析?；诘湫蚏TT病例，以RSSS為因變量，以GDS-C各能區(qū)發(fā)育商、CSHQ總分、腦灰白質(zhì)MR參數(shù)為自變量，行多元線性回歸分析。

1.2 典型RTT診斷標準[2]RTT診斷標準中有4項主要標準和11項支持標準，典型RTT診斷需同時滿足4項主要標準：①已習得的目的性手技能部分或完全喪失，②已習得的口語能力部分或完全喪失，③步態(tài)異常：能力受損(運用障礙)或沒有能力，④手刻板動作，例如絞手/緊握手、拍手/輕敲手、吃手、洗手/搓手樣動作。

1.3MECP2基因檢測 血標本處理、測序、變異分析和結(jié)果解讀均參照復旦大學附屬兒科醫(yī)院(我院)分子診斷中心建立的高通量測序數(shù)據(jù)分析和臨床診斷流程2.0[13]。MECP2基因測序：PCR擴增檢測MECP2基因編碼區(qū)外顯子。 基因組DNA多重連接探針擴增技術(shù)(MLPA)：使用由荷蘭(MRC-Holland, Amsterdam, Netherlands)生產(chǎn)的P015C試劑盒檢測MECP2基因的拷貝數(shù)變異(基因缺失/重復)。

1.4 病例納入標準 同時滿足以下4項。①2014年7月至2021年6月于我院兒?？圃\斷為典型RTT的連續(xù)病例，②存在MECP2致病性變異，③行頭顱MR常規(guī)掃描檢查，④行GDS-C、RSSS評估和CSHQ問卷調(diào)查。

1.5 倫理和知情同意 本文為國家自然科學基金(項目編號：81701129，82171540)和上海市臨床重點?？?項目編號：shslczdzk02903)項目，項目通過我院倫理委員會批準，批準文號：復兒倫審[2014125號]?；純杭议L均簽署基因檢測和MR檢查知情同意書。

1.6 行為評估和臨床分期 行為評估包括：RSSS、GDS-C和CSHQ，RSSS和GDS-C評估均由我院至少2名兒童保健科醫(yī)生完成，測評結(jié)果取平均值，CSHQ為家長問卷調(diào)查，均與MR檢查相距≤1個月完成；RTT臨床分期由兒童保健?？漆t(yī)生評估。

1.6.1 RSSS 包括抽搐發(fā)作頻率及控制情況、呼吸異常、脊柱側(cè)彎、行走能力、手的功用、語言、睡眠7個參數(shù)，每個參數(shù)評分范圍從0(缺失/正常)至3(嚴重)，總分最大值為21分(最嚴重)。

1.6.2 GDS-C 包括總發(fā)育商和5個分能區(qū)(粗大運動、個人-社會能力、語言、手眼協(xié)調(diào)和表現(xiàn))發(fā)育商。發(fā)育商=發(fā)育月齡/實際月齡×100%。

1.6.3 CSHQ 從8個維度反映兒童常見睡眠問題：就寢習慣不良、入睡潛伏期延長、睡眠持續(xù)時間不規(guī)律、睡眠焦慮、夜醒、異態(tài)睡眠、睡眠呼吸障礙、白天嗜睡?？傇u分>41 分即為睡眠質(zhì)量不良，評分越高表示睡眠質(zhì)量越差。

1.6.4 RTT臨床分期[14]Ⅰ期：發(fā)病早期停滯期，通常出現(xiàn)在生后6～18個月，可持續(xù)數(shù)周至數(shù)月甚至≥1年；Ⅱ期：發(fā)育快速倒退期，通常從1～4歲開始，可持續(xù)數(shù)周至1年；Ⅲ期：假性穩(wěn)定期，通常從2～10歲開始，可持續(xù)數(shù)年至10年；Ⅳ期：晚期運動惡化期，通常從10歲后開始至成年，可持續(xù)數(shù)年或數(shù)十年。

1.7 MR檢查 使用GE Discovery MR750 3.0T磁共振機進行掃描，線圈為頭顱32通道矩陣線圈，掃描序列為T1加權(quán)序列(T1 BRAVO)及DTI序列(SE-EPI)。在掃描前于我院鎮(zhèn)靜中心在醫(yī)生監(jiān)管下給予口服10%水合氯醛(50 mg·kg-1)且待患兒熟睡后行影像學檢查。T1 BRAVO掃描參數(shù)：TR 8.2 ms，TE 3.2 ms，F(xiàn)OV 256 mm，矩陣256×256，像素1 mm×1 mm×1 mm，間距0；DTI SE-EPI序列掃描參數(shù)：TR 4 600 ms，TE 87.4 ms，F(xiàn)OV 240 mm，矩陣128×128，像素2 mm×2 mm×4 mm，間距0，b值分別0、1 000 s·mm-2，彌散敏感梯度方向15個方向。

1.8 MR影像數(shù)據(jù)處理 影像數(shù)據(jù)由我院兒童神經(jīng)影像專業(yè)人員處理。將圖像原始Dicom格式轉(zhuǎn)換為nii格式，使用MRIcron軟件(www.mricro.com)檢查圖像質(zhì)量，剔除偽影、錯層等缺陷的被試。對于T1加權(quán)數(shù)據(jù)，使用基于MATLAB R2014b運行環(huán)境采用統(tǒng)計參數(shù)圖(SPM)10 軟件(https://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/software/spm10)進行分析，通過配準、組織分割、平滑的全腦體積標準流程處理后，獲得全腦體積(TIV)、灰質(zhì)體積(GMV)及白質(zhì)體積(WMV)。對于DTI數(shù)據(jù)使用FSL軟件中的FDT工具包對DTI圖像進行校正，使用DTIFit工具包計算得到DTI圖像的相關(guān)參數(shù)，包括各向異性(FA)：反映水分子各向異性成分占整個彌散張量的比例，間接反映白質(zhì)纖維束的完整性，其值越低提示纖維束越不完整性；平均彌散量(MD)：反映分子整體彌散水平及細胞細胞膜密度，其值越高說明細胞膜密度越低；徑向彌散率(RD)：可能提示髓鞘完整性，其值越高提示髓鞘完整性越低；軸向彌散率(AD)：反映軸索完整性，其值越高提示軸索完整性越低。

1.9 統(tǒng)計分析 描述性分析包括連續(xù)數(shù)據(jù)的平均值和標準差，應用SPSS 26.0進行多元線性回歸分析，顯著性級別(單尾)設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果

表1 22例典型RTT患兒MECP2不同基因型的臨床表型及臨床嚴重程度

2.2 臨床嚴重程度、發(fā)育水平及睡眠障礙情況 22例典型RTT患兒，①RSSS均值為(5.91±1.38)分；②臨床分期為Ⅱ～Ⅲ期；③GDS-C總發(fā)育商為17.9±7.9，運動能區(qū)發(fā)育商為33.2±13.3，個人-社會能區(qū)發(fā)育商為17.5±9.3，語言能區(qū)發(fā)育商為15.0±8.6，手眼協(xié)調(diào)能區(qū)發(fā)育商為12.6±7.8，表現(xiàn)能區(qū)發(fā)育商為11.2±6.8；④CSHQ總分為(54.0±5.5)分，平均睡眠時間為(8.7±1.1)h，異常維度個數(shù)為(6.9±1.0)個，睡眠總分最小值為43(>41)分，均存在睡眠質(zhì)量不良。

2.3 MR影像結(jié)果 22例典型RTT患兒，TIV=1 118.3±102.1，GMV=566.5±53.8，WMV=287.6±38.0；白質(zhì)DTI參數(shù)FA=0.183 5±0.007 9，MD=0.001 1±0.000 1，RD=0.001 2±0.000 1，AD=0.001 0±0.000 1。

2.4 相關(guān)性分析 以RSSS為因變量，以GDS-C發(fā)育商和5個分能區(qū)發(fā)育商，CSHQ總分，MR參數(shù)TIV、GMV、WMV、FA、MD、RD及AD為自變量，多元線性回歸分析結(jié)果(圖1)顯示，RSSS與GDS-C的個人-社會能區(qū)發(fā)育商(r=-0.518,P=0.007)、手眼協(xié)調(diào)能區(qū)發(fā)育商(r=-0.4,P=0.032)、總發(fā)育商(r=-0.429,P=0.023)，MR參數(shù)的GMV(r=-0.571,P=0.003)、WMV(r=-0.514,P=0.007)、FA(r=-0.472,P=0.013)、MD(r=0.519,P=0.007)、RD(r=0.528,P=0.006)、AD(r

圖1 以RSSS為因變量的相關(guān)分析示意圖

3 討論

本研究中22例典型RTT均存在MECP2基因致病性變異，主要位于exon4及exon3，且大部分位于exon4。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)主要位于甲基結(jié)合域(MBD)及轉(zhuǎn)錄抑制域(TRD)。22例患兒平均年齡(3.1±0.8)歲，均處于Ⅱ～Ⅲ期，RSSS為(5.91±1.38)分，GDS-C總發(fā)育商為17.89±7.93，CSHQ總分為(54.0±5.5)分，均存在睡眠質(zhì)量不良。

既往臨床表型研究報道RTT患兒存在不同程度的發(fā)育落后[2, 15]。本研究中相關(guān)分析結(jié)果顯示，RSSS與GDS-C的總發(fā)育商及個人-社會能區(qū)、手眼協(xié)調(diào)能區(qū)發(fā)育商呈顯著負相關(guān)，提示發(fā)育程度越落后，臨床嚴重程度越重。此外，睡眠障礙嚴重影響RTT患兒及其家人的日常生活質(zhì)量[16]，本研究中22例RTT患兒均存在睡眠質(zhì)量不良，可解釋睡眠模式受損屬于典型RTT診斷的支持標準。

既往報道RTT患者MECP2變異大部分位于exon4，可能是因為它是該基因最大的外顯子，并編碼MECP2蛋白的重要結(jié)構(gòu)域[17]。本研究中大多數(shù)致病變異與既往文獻報道類似，發(fā)生在CpG熱點的C>T轉(zhuǎn)變，包括c.316C>T、c.382C>T、c.397C>T、c.455C>G、c.473C>T、c.502C>T、c.602C>T、c.763C>T、c.808C>T、c.880C>T及c.916C>T。除了熱點區(qū)域的致病性變異，RTT也存在C末端的插入或缺失導致的移碼變異和早期截斷[18]。本研究中單堿基重復致移碼變異c.753dupC 1例(例14)、缺失變異c.1454_1457del 1例(例21)。另外，本研究中有1例(例22)MECP2基因測序未檢測到致病性變異，但MLPA檢測到exon4缺失。

另外，不同的基因型所呈現(xiàn)的臨床癥狀嚴重程度也不同。既往大樣本基因型及表型相關(guān)性研究采用疾病臨床嚴重度評分(CSS)發(fā)現(xiàn)p.R133C、p.R294X、p.R306C、exon1 del和3'截斷變異的分數(shù)較低，而p.R106W、p.R168X、p.R255X、p.R270X、剪接位點、大缺失、插入和缺失的分數(shù)較高[19]。本研究使用特異性RSSS發(fā)現(xiàn)p.R133C(5分)及p.R306C(4.7分)分數(shù)偏低，提示臨床癥狀輕；p.R255X(7分)及p.R270X(6分)分數(shù)偏高、缺失變異c.1454_1457del TTAG(8分)及大片段缺失exon4 del(10分)分數(shù)較高，提示臨床癥狀重，與文獻報道一致。

RTT患兒存在頭圍減少和腦容量減少，既往影像學研究發(fā)現(xiàn)，灰質(zhì)腦容量的減少多在枕葉及頂葉后部，呈區(qū)域性分布，而大腦白質(zhì)容量則呈整體性的減低[8, 9]，但尚無與RTT疾病嚴重程度的相關(guān)性探討。本研究相關(guān)性分析提示，典型RTT的RSSS與GMV、WMV以及白質(zhì)的FA呈負相關(guān)，而與白質(zhì)的MD、RD和AD呈正相關(guān)。本研究中灰白質(zhì)參數(shù)與典型RTT的RSSS的顯著相關(guān)性結(jié)果，提示典型RTT患兒腦灰質(zhì)白質(zhì)容量越小，其臨床嚴重度越高；白質(zhì)纖維束、髓鞘及軸索完整性越低，其臨床嚴重度越高。此外，RSSS分值較低的變異，如p.R133C(GMV 574, WMV 305)及p.R306C(GMV 593, WMV 309)，比RSSS分值較高的變異，如c.1454_1457del TTAG(GMV 534, WMV 237)及exon4 deletion(GMV 445, WMV 249)，大腦灰白質(zhì)容積較大。既往尚無對不同基因型與腦容量或腦結(jié)構(gòu)異常的相關(guān)性研究。未來大樣本的多序列的MR研究，可進一步證實不同基因型與疾病嚴重程度及腦結(jié)構(gòu)及功能損傷的相關(guān)性。

本文不足：①本研究為橫斷面相關(guān)性研究，僅能反映典型RTT患兒RSSS與GDS-C、CSHQ和結(jié)構(gòu)MR參數(shù)相關(guān)性，并不能反映關(guān)聯(lián)程度，②樣本量不足，③典型RTT患兒RSSS缺乏階梯化的評估，不能更準確地反映典型RTT患兒RSSS程度。