鐘麗娟，池景良，陳 飛，趙新海，張慶華，韓 冰，關艷麗

（遼寧省微生物科學研究院，遼寧 朝陽 122000）

2018年在遼寧省朝陽市喀左縣開展食用菌產(chǎn)業(yè)科技服務工作時，發(fā)現(xiàn)黑木耳菌棒在菌絲生長期，易發(fā)生疑似黃曲霉（Aspergillus flavus Lk.）侵染引起的競爭性雜菌病害，菌棒發(fā)病率達20%。該病發(fā)病較快，接種后10 d～15 d菌棒即出現(xiàn)染菌癥狀，染病初期出現(xiàn)白色菌絲，相較正常的黑木耳菌絲生長稀疏；染病后期菌棒變淺黃色，塑料膜下可見大量黃色粉狀孢子，其外觀狀態(tài)與黃曲霉侵染引起的病害癥狀相似，嚴重危害黑木耳生產(chǎn)。為進一步明確病害發(fā)生原因，對染病菌進行了顯微鏡檢，發(fā)現(xiàn)該病原菌分生孢子梗為瓶梗型，即基部球形或橢圓形膨大，向上變細呈明顯的頸部。菌絲有橫隔，頂端不形成膨大的頂囊，其分生孢子梗經(jīng)過多次分枝，產(chǎn)生幾輪對稱或不對稱的小梗，形如掃帚狀，其形態(tài)特征與黃曲霉具有典型橢圓形或近球形的頂囊有明顯區(qū)別，而與《真菌鑒定手冊》中描述的擬青霉屬真菌形態(tài)相近[1]。

目前關于食用菌生產(chǎn)中因曲霉屬（Aspergillus）、木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）、擬青霉屬（Paecilomyces）等雜菌引起的病害研究都集中在綜合防治等方面，如徐志偉[2]、宋睿男[3]等報道了食用菌生產(chǎn)中常見病害的鑒定及其防治方法，從原料選擇、培養(yǎng)期環(huán)境溫濕度控制、各環(huán)節(jié)人員操作注意事項等方面提出了綜合防治策略，而對生產(chǎn)中造成危害的病原菌所開展的研究并不多。楊武等[4]分離出黑木耳綠霉病的病原菌為長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum），并測定98%咯菌腈10倍稀釋液對該菌的抑菌率可達97.8%；趙瑞華等[5]對工廠化海鮮菇菌包污染霉菌進行了分離鑒定，研究表明克霉靈和多菌靈可以有效防治木霉和青霉等雜菌。可見，綜合防治措施是建立在對每一種病原菌細致研究的基礎上系統(tǒng)整合而成，特別是對于新發(fā)生、不常見的病害，其病原菌生長特性的全面研究對于針對性地提出有效防治措施非常必要。因此，通過分離純化黑木耳菌絲生長期危害較嚴重的競爭性雜菌，開展形態(tài)學和分子生物學鑒定，明確病原種類，并開展生物學特性研究，旨在為該類病害的綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

綜合PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖 20 g、KH2PO43 g、瓊脂 18 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121℃滅菌30 min，倒平板后冷卻備用。

1.2 菌株來源

2018年3月取喀左縣黑木耳栽培基地染菌棒，采用組織法分離[6]。菌種分離純化方法按參考文獻[4]，將染病菌棒于無菌條件下剪開，用接種針挑取不同部位染病培養(yǎng)料，接種至綜合PDA培養(yǎng)基中央，重復6次。后于28℃培養(yǎng)72 h，觀察菌落形態(tài)特征。挑取目的菌落進行鏡檢，其分生孢子梗為瓶梗型，濃密不規(guī)則分支，掃帚狀，分生孢子串生。挑取目的菌落邊緣菌絲，接種至綜合PDA培養(yǎng)基中央，經(jīng)2次～3次純化后，將菌種轉(zhuǎn)接至斜面綜合PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)72 h后置于4℃冰箱保存，標記為SM-01。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 菌株形態(tài)學鑒定

挑取約0.5 cm×0.5 cm的冰箱保藏菌株組織塊，接種于綜合PDA培養(yǎng)基中央，共10個重復。其中5皿平板用于觀察菌落形態(tài)；另外5皿平板用滅菌的鑷子各斜插入4片滅菌蓋玻片，距離接種點約2 cm，用于觀察菌絲及孢子等顯微形態(tài)。將各平板置于28℃培養(yǎng)，培養(yǎng)72 h后觀察菌落生長情況，及時進行分生孢子梗、分生孢子及菌絲的顯微觀察。

參照《真菌鑒定手冊》[1]《中國真菌志第三十五卷青霉屬及其相關有性型屬》[7]、Brown等[8]的方法進行菌株形態(tài)學鑒定。

1.3.2 菌株 ITS 序列分析

菌絲體DNA提取參考劉艷梅等[9]、張曉利等[10]的方法并略加改進，考慮到試驗菌株生長至72 h已產(chǎn)孢，為獲得相對純度高的DNA樣品，選擇收集培養(yǎng)48 h的菌絲，無菌水洗滌2次后，用無菌濾紙吸干菌絲表面水分，裝入EP管于-20℃保存?zhèn)溆谩NA提取使用上海生工生物工程股份有限公司Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒。PCR引物選擇通用引物 ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。反應體系及反應條件參照王小欣[11]方法進行。擴增產(chǎn)物由上海生工生物工程股份有限公司（上海）進行純化與測序。測序結(jié)果在NCBI上進行Blast比對，并將菌株SM-01 ITS序列與已報道的擬青霉屬菌株進行比較，采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌株SM-01生物學特性研究

1.4.1 菌塊準備

將4℃冰箱保藏的菌株轉(zhuǎn)接至綜合PDA平板，培養(yǎng)72 h至菌落直徑60 mm左右，用直徑為6 mm的打孔器沿菌落邊緣打取菌塊備用。

1.4.2 溫度試驗

將菌塊接種至綜合PDA平板中央，共接種18皿，每3皿為一組，分別放置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，使用游標卡尺，采用十字交叉法測定菌落直徑。

1.4.3 pH 試驗

將綜合 PDA 培養(yǎng)基用 1 mol·L-1HCl和 1 mol·L-1NaOH分別調(diào)pH至6、7、8、9，制成不同pH的培養(yǎng)基。每種pH培養(yǎng)基制備3皿平板，并標記清楚，將菌塊接種至各平板中央，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)4 d，使用游標卡尺，采用十字交叉法測定菌落直徑。

1.4.4 統(tǒng)計

計算菌絲生長速率，試驗數(shù)據(jù)用SPSS 25.0進行差異顯著性檢驗。菌絲生長速率（V，mm·d-1）的計算公式為：

式中：S為菌絲生長長度（mm）；D為菌絲生長天數(shù)（d）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株SM-01鑒定結(jié)果

染病菌棒形態(tài)特征見圖1。

圖1 染病菌棒形態(tài)特征Fig.1 Characteristics of fungi sticks infestation by pathogens

由圖1可知，正常黑木耳菌棒應為白色菌絲，而該病原菌導致的黑木耳染病菌棒為淺黃色或淺黃褐色，表現(xiàn)為花棒的形態(tài)，塑料膜下可見大量黃色粉狀孢子，其外觀狀態(tài)與黃曲霉侵染引起的癥狀相似，菌株SM-01在綜合PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見圖2，顯微形態(tài)見圖3。

圖2 菌株SM-01在綜合PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain SM-01 grown on PDA medium

圖3 菌株SM-01顯微形態(tài)Fig.3 Microscopic morphology of strain SM-01

如圖2、圖3所示，采用組織分離法從染病菌棒中分離出病原菌SM-01，在綜合PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)120 h，菌落直徑90 mm左右，菌落絨毛狀、平展，邊緣整齊，菌落初期白色，產(chǎn)孢后呈土黃色，菌落背面白色。光學顯微鏡下，菌絲無色透明，有分隔，直徑 2.1 μm～3.5 μm。分生孢子梗為瓶梗型，基部球形或橢圓形膨大，向上變細呈明顯的頸部，大小約 （6.3～15.2）μm× （1.5～2.3）μm，濃密分枝，無明顯規(guī)律。分生孢子橢圓形，串生，長鏈，大小約 （2.3～3.4）μm× （3.5～5.2）μm。

該菌株顯微形態(tài)學特征與擬青霉屬真菌和穗霉屬真菌描述相似[1]。擬青霉屬真菌的瓶梗著生于不規(guī)則分支的分生孢子梗上，或形成輪生體；瓶?；颗虼螅蛏贤蝗蛔兗毘梢婚L頸，分生孢子鏈狀，分生孢子橢圓形；穗霉屬真菌分生孢子梗分支多，頂部輪生輻射狀松散排列的分生孢子梗，分生孢子串生，球形，長圓形或梭形。擬青霉屬真菌菌落多為黃色至黃褐色，穗霉屬真菌菌落多為白色和淺色的菌落，試驗菌株菌落顏色為黃褐色，其形態(tài)特征更符合擬青霉屬真菌特征。按Brown&Smith[8]的分類檢索方法，將穗霉屬、青霉屬和棒束孢屬（Isaria）中的很多種列入擬青霉屬中，指出擬青霉與其近緣屬青霉和膠帚霉（Gliocladium）的主要區(qū)別是，其瓶?；颗虼?，向上變細的頸部多彎曲，常偏離主軸。瓶梗著生情況復雜，有的呈輪狀，有的不規(guī)則地叢生于短的小枝上，有的單個分散于氣生菌絲上。分生孢子鏈狀，一些種在潮濕條件下可形成傾斜排列的鏈，甚至可粘結(jié)成疏散的球頭狀。菌落白色或灰白、淡褐色，偶爾具淡綠色，但絕不呈真正的綠色。因此，根據(jù)形態(tài)學描述，初步鑒定試驗菌株為擬青霉屬（Paecilomyces）真菌。

為進一步明確菌株SM-01的分類地位，對其進行ITS序列分析，通過PCR擴增獲得581 bp的ITS序列，登錄NCBI系統(tǒng)進行Blast比對，并將菌株SM-01的ITS的序列與已報道的擬青霉屬菌株進行比較，采用MEGA 7.0構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。

圖4 菌株SM-01基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain SM-01 based on ITS sequences

由圖4分析結(jié)果顯示，菌株SM-01與 Paecilomyces formosus F3、Paecilomyces formosus DW11、Paecilomyces formosus M1861等菌株的ITS序列同源性為100%，通過1 000次自舉分析（Bootstrap）進行系統(tǒng)進化分析，該菌與Paecilomyces formosus F3親緣關系最為密切，Bootstrap值為70%，構(gòu)建的進化樹較為可靠。

2.2 菌株SM-01生物學特性測定

2.2.1 溫度對菌株SM-01菌絲生長的影響

溫度對菌株SM-01菌絲生長的影響結(jié)果見圖5。

圖5 溫度對菌株SM-01菌絲生長的影響Fig.5 Effect of temperature on mycelium growth of strain SM-01

通過測定，在溫度15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃條件下，菌絲生長速率分別為0.46 mm·d-1、3.44 mm·d-1、5.70 mm·d-1、10.98 mm·d-1、 11.99 mm·d-1、3.30 mm·d-1，差異顯著 （P＜0.05）。由圖5可知，菌株SM-01對溫度較為敏感，菌絲在30℃～35℃生長快速，該條件下菌絲生長速率約為25℃時的2倍，與其他各處理差異顯著；溫度低于15℃時，菌絲幾乎不生長；溫度低于20℃時，菌絲生長緩慢，生長狀態(tài)正常；溫度高于40℃，菌絲生長緩慢，菌落顏色為白色，生長狀態(tài)與其他處理不同。

2.2.2 pH對菌株SM-01菌絲生長的影響

pH對菌株SM-01菌絲生長的影響見圖6。

圖6 pH對菌株SM-01菌絲生長的影響Fig.6 Effect of pH on mycelium growth of strain SM-01

由圖2、圖6可知，結(jié)合生產(chǎn)中配方pH的實際情況，在pH為6、7、8、9條件下，菌絲生長速率分別為 10.33 mm·d-1、9.30 mm·d-1、8.79 mm·d-1、8.36 mm·d-1，差異顯著 （P＜0.05）。菌株 SM-01 菌絲在供試pH條件下均生長良好，且相較而言中性偏酸性條件下菌絲生長略優(yōu)于弱堿性條件。

3 討論與結(jié)論

通過形態(tài)學鑒定和ITS序列分析，明確了1株黑木耳染菌病原菌SM-01隸屬于半知菌亞門（Deuteromycotina）絲孢綱 （Hyphomycetes）叢梗孢目 （Monilales）叢梗孢科 （Monilaceae）擬青霉屬（Paecilomyces）真菌 （Paecilomyces formosus），對其生物學特性進行了初步研究。結(jié)果表明，該菌的菌絲生長最適溫度為30℃～35℃，在pH 6～9的培養(yǎng)基中菌絲生長良好，酸性條件更適宜其生長。在2019年和2020年未發(fā)現(xiàn)該菌危害，結(jié)合2018年菌種及原料檢測結(jié)果，推測病害發(fā)生是隨機導致。防治該病害的策略主要可通過控制培養(yǎng)溫度，在黑木耳生產(chǎn)過程中常存在養(yǎng)菌溫度超過30℃的高溫養(yǎng)菌現(xiàn)象，不僅會造成黑木耳菌絲受損，還會加重霉菌發(fā)生[12]，結(jié)果表明當溫度低于25℃時，菌株SM-01生長緩慢，因此在生產(chǎn)中應注意培養(yǎng)期的溫度管理，以避免霉菌優(yōu)先生長[13]。

通過檢索萬方數(shù)據(jù)庫、CNKI全文數(shù)據(jù)庫和springlink外文數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)關于該菌的報道較少，研究時間集中在2012年至今，研究方向為其代謝產(chǎn)物和對人體的致病性等方面。Bulla等[14]研究表明該菌可以降解多種染料，具有環(huán)境修復潛力，Saqib等[15]測試了從黃瓜根系中分離出的Paecilomyces formosus LHL10的酶抑制潛力，結(jié)果表明其乙酸乙酯提取物對脲酶和α-葡萄糖苷酶具有明顯的抑制潛力。Heshmatnia等[16]報道了該菌可導致成年人慢性肉芽腫。曲霉屬、木霉屬、青霉屬等有害菌一直嚴重危害食用菌生產(chǎn)，引起營養(yǎng)競爭性病害，是導致培養(yǎng)期菌棒染菌的主要原因[17]。醫(yī)學研究表明，曲霉屬能夠引起肺曲霉病[18]；木霉屬真菌長梗木霉（Trichoderma longibrachiatum）可感染人體引起侵襲性腹膜炎[19]；擬青霉屬真菌宛氏擬青霉（Paecilomyces variotii）可導致人體肺部感染；淡紫擬青霉[Paecilomyces lilacinus（Thorn.）Samson]會引起人體眼角膜潰瘍[20-21]。通過研究明確了一種導致黑木耳培養(yǎng)期病害的病原菌分類所屬，進而對其生物學特性和危害進行研究，為其后續(xù)的防治及人員安全防護提供理論依據(jù)。但目前在食用菌生產(chǎn)中往往容易忽視人體安全防護問題，因此建議從業(yè)人員在進行生產(chǎn)操作時，應加強必要的勞動保護，如佩戴口罩、手套等。