馮婷婷，劉 利，郭九峰，宋天磊，劉超雄

（內(nèi)蒙古大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

蟹味菇（Hypsizygus marmoreus）屬擔(dān)子菌亞門(mén)（Basidiomycotina）傘菌目 （Agaricales）白蘑科（Tricholomataceae）玉蕈屬（Hypsizigus），又名真姬菇、玉蕈等，是外形美觀、口感獨(dú)特的食藥兼用的珍稀食用菌，具有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值，在市場(chǎng)上頗受歡迎。其子實(shí)體含有豐富的維生素、多糖、多肽、17種氨基酸和多種人體必需的礦物質(zhì)[1]。工廠化規(guī)模生產(chǎn)中，蟹味菇菌絲發(fā)菌緩慢，后熟期時(shí)間較長(zhǎng)，整個(gè)生長(zhǎng)周期較常見(jiàn)食用菌長(zhǎng)兩倍左右，同時(shí)對(duì)外界環(huán)境要求較為嚴(yán)格[2]。原生質(zhì)體電致誘變研究有望篩選出提高菌株生長(zhǎng)速度的優(yōu)質(zhì)突變菌種，同時(shí)可為蟹味菇菌種改良和選育技術(shù)提供新的思路和方法，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

原生質(zhì)體誘變技術(shù)是菌種選育和改良的重要方法之一，具有方法簡(jiǎn)便、周期短、一次誘變就能獲得大量突變菌株的特點(diǎn)。利用原生質(zhì)體誘變選育優(yōu)良菌株的研究已有很多較全面的報(bào)道，在微生物食用菌菌種改良和育種領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用[3-9]。誘變機(jī)理為通過(guò)對(duì)底物進(jìn)行物理或化學(xué)誘變劑處理，常采用紫外線(xiàn)、電場(chǎng)、離子束等方法進(jìn)行誘變，使生物體細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生變異，從而篩選出變異菌株，培育出新的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)菌株。采用更為安全環(huán)保的物理誘變方法[10]。菌株原生質(zhì)體為誘變材料具有誘變率高、敏感性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，利于增加其開(kāi)發(fā)利用價(jià)值及優(yōu)質(zhì)菌株的篩選[11]。同時(shí)，用電場(chǎng)誘變可以擬發(fā)基因突變，當(dāng)給予不同的外加電場(chǎng)作用，會(huì)使菌株細(xì)胞表面所帶電荷發(fā)生變化，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)帶來(lái)不同程度的影響，進(jìn)而可以篩選出良性誘變菌株及其誘變參數(shù)。

目前，國(guó)內(nèi)外研究多為對(duì)蟹味菇子實(shí)體、菌絲體誘變育種，原生質(zhì)體制備技術(shù)探究的研究報(bào)道，以及以微生物為材料，利用高壓電暈電場(chǎng)（交流高壓電源裝置和針、板電極組成高壓電暈電場(chǎng)裝置，加上高壓后，在場(chǎng)強(qiáng)最大的針尖尖端處會(huì)產(chǎn)生局部放電-電暈現(xiàn)象），以此進(jìn)行誘變處理。裝置進(jìn)行誘變處理方面的探究[12-13]，如董先茹[14]對(duì)蟹味菇菌株離子束誘變選育進(jìn)行了研究，篩選出綜合營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高的誘變菌株。袁麗麗等[15]通過(guò)對(duì)北蟲(chóng)草菌分生孢子進(jìn)行高壓電暈電場(chǎng)誘變處理，獲得了北蟲(chóng)草新的突變菌株。在蟹味菇原生質(zhì)體高壓電暈電場(chǎng)誘變方面的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

試驗(yàn)選取高壓電暈電場(chǎng)裝置，以蟹味菇原生質(zhì)體為材料，通過(guò)電場(chǎng)誘變處理，探尋對(duì)菌株生長(zhǎng)速度的影響及獲得優(yōu)質(zhì)突變菌株的新途徑。通過(guò)篩選出菌絲體生長(zhǎng)速度快的突變菌株，為選育蟹味菇優(yōu)質(zhì)突變菌株及菌種的后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

蟹味菇（Hypsizygus marmoreus）菌株，內(nèi)蒙古大學(xué)離子束實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 加強(qiáng) PDA 培養(yǎng)基

去皮馬鈴薯 200.0 g、蔗糖 10.0 g、瓊脂 10.0 g、葡萄糖 10.0 g、細(xì)菌學(xué)蛋白胨 1.6 g、酵母提取粉 1.6 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、水 1.0 L。

1.2.2 液體培養(yǎng)基

去掉上述培養(yǎng)基中的瓊脂，其余成分相同。

1.2.3 原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基

馬鈴薯 200.0 g、蔗糖 10.0 g、瓊脂 10.0 g、葡萄糖 10.0 g、細(xì)菌學(xué)蛋白胨 1.6 g、酵母提取粉 1.6 g、KH2PO41.0g、MgSO40.5g、抗生素 100.0mg、水 1.0L。

1.2.4 二級(jí)培養(yǎng)基

檸條：水：甘草粉質(zhì)量比為1∶2∶0.05。

1.3 溶液的配制

1.3.1 0.6 mol·L-1甘露醇穩(wěn)滲劑

稱(chēng)取10.93 g甘露醇，定容于100.00 mL容量瓶中，經(jīng)微孔過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后備用。

1.3.2 1%溶壁酶

稱(chēng)取0.1 g溶壁酶溶于10.0 mL穩(wěn)滲劑中，待完全溶解，經(jīng)微孔過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后備用。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌絲培養(yǎng)

取小塊菌種接種于固體平板PDA培養(yǎng)基中，24℃避光培養(yǎng)。

1.4.2 原生質(zhì)體的制備

將PDA培養(yǎng)所得菌絲體轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床150 r·min-1，暗培養(yǎng)7 d可得適于原生質(zhì)體制備的菌絲。以0.6 mol·L-1甘露醇作為穩(wěn)滲劑，取過(guò)濾后的菌絲0.3 g，將菌絲收集于離心管中，用無(wú)菌水反復(fù)洗滌，3 500 r·min-1離心330 s，棄上清，再加入穩(wěn)滲劑洗滌3次，用濾紙吸去多余水分。加入200 μL溶壁酶，置于25℃恒溫?fù)u床上酶解，210 min后加入300 μL穩(wěn)滲劑，3 500 r·min-1離心5 min，取上清液用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾，得原生質(zhì)體懸浮液。取10 μL原生質(zhì)體懸浮液于顯微鏡下用過(guò)血球計(jì)數(shù)板觀察計(jì)數(shù)，用穩(wěn)滲劑將原生質(zhì)體懸液濃度稀釋至106個(gè)/mL。

1.4.3 原生質(zhì)體電暈電場(chǎng)誘變及再生

置高壓電暈放電裝置于超凈臺(tái)中，誘變處理前打開(kāi)紫外燈滅菌30 min，誘變時(shí)打開(kāi)超凈臺(tái)風(fēng)扇，避免水蒸氣對(duì)針尖放電產(chǎn)生影響[11-13]。取稀釋后原生質(zhì)體懸液2 mL于直徑3.5 cm的一次性培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕搖勻，置于電暈電場(chǎng)，處理過(guò)程中針尖與液面間距離保持在0.7 mm，分別設(shè)置低電壓長(zhǎng)時(shí)間、高電壓短時(shí)間組合進(jìn)行處理，見(jiàn)表1。

表1 電暈電場(chǎng)誘變參數(shù)Tab.1 Mutagenesis parameter of corona electric field

如表1所示的每個(gè)處理重復(fù)3次。將誘變處理后的各組原生質(zhì)體液分別取200 mL凃板于再生培養(yǎng)基中，每個(gè)處理涂3個(gè)PDA再生平板，并取未經(jīng)電場(chǎng)處理的原生質(zhì)體液為對(duì)照組進(jìn)行凃板。于24℃暗培養(yǎng)，待平板長(zhǎng)出菌落后，計(jì)數(shù)再生菌落個(gè)數(shù)、原生質(zhì)體再生率及致死率，每個(gè)試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)，取平均值。原生質(zhì)體再生率（Yz，%）計(jì)算公式為：

式中：Z為再生菌落數(shù)（個(gè)）；Y為原生質(zhì)體總數(shù)（個(gè)）。

致死率（S，%）計(jì)算公式為：

式中：Z為再生菌落數(shù)（個(gè)）；Y為原生質(zhì)體總數(shù)（個(gè)）。

1.4.5 突變菌株的篩選

從不同電場(chǎng)條件處理誘變得到的突變?cè)偕曛刑暨x出9個(gè)生長(zhǎng)較快、菌落飽滿(mǎn)的單個(gè)再生菌株，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)觀察。同時(shí)培養(yǎng)3個(gè)未經(jīng)誘變處理的菌株作為對(duì)照組。

1.4.6 檸條固體培養(yǎng)

轉(zhuǎn)接后的單個(gè)菌株培養(yǎng)至1個(gè)平皿，選取30支20 mm×200 mm試管，按照檸條：水：甘草粉質(zhì)量比為1∶2∶0.05的比例，裝滿(mǎn)檸條粉壓緊，滅菌后接入菌種，包括未經(jīng)原生質(zhì)體誘變處理的原始菌，每個(gè)菌接3支試管，編號(hào)、觀察并記錄各自生長(zhǎng)速度以及菌絲體形態(tài)變化等。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體的制備

通過(guò)血球計(jì)數(shù)板觀察計(jì)數(shù)，菌齡7 d、溶壁酶酶解3.5 h，獲得蟹味菇菌絲體的原生質(zhì)體制備率為2.5×108個(gè)/mL。

2.2 電暈電場(chǎng)誘變處理蟹味菇原生質(zhì)體的致死效應(yīng)

經(jīng)電暈電場(chǎng)不同電壓、時(shí)間條件處理后蟹味菇菌絲體原生質(zhì)體的再生菌落個(gè)數(shù)及致死率見(jiàn)表2，菌落個(gè)數(shù)對(duì)比見(jiàn)圖1。

表2 不同誘變條件下原生質(zhì)體致死率的比較Tab.2 Comparison of the lethal rate of protoplasts under different mutagenesis conditions

由表2和圖1可知，未經(jīng)電場(chǎng)處理的對(duì)照組再生菌落個(gè)數(shù)明顯多于誘變處理后。當(dāng)處理?xiàng)l件為4 kV誘變14 min、6 kV誘變5 min、6 kV誘變8 min、6 kV誘變10 min、8 kV誘變4min時(shí)可獲得再生菌落，致死率69.39%～95.92%；隨著電壓增大，致死率不斷增加。其余處理?xiàng)l件下致死率100%。從整體上看，高電壓短時(shí)間處理組更易獲得突變菌株，在處理?xiàng)l件為 8kV誘變4 min時(shí)致死率達(dá)最高95.92%。單個(gè)菌落生長(zhǎng)速度對(duì)比見(jiàn)圖2。

圖2 單個(gè)菌落生長(zhǎng)速度對(duì)比Fig.2 Comparison of single colony growth rate

由圖2可知，電壓為6 kV時(shí)，處理時(shí)間越長(zhǎng)菌絲體越密集，菌絲生長(zhǎng)越快，直徑越大。說(shuō)明蟹味菇原生質(zhì)體對(duì)于電致誘變條件的變化較為敏感。

2.3 誘變處理后再生菌株生長(zhǎng)量變化情況

經(jīng)檸條固體培養(yǎng)試驗(yàn)，各再生菌株菌絲體長(zhǎng)至2.5 cm所需天數(shù)見(jiàn)圖3，菌絲體生長(zhǎng)速度變化見(jiàn)圖4。

圖3 菌絲體生長(zhǎng)至2.5 cm所需天數(shù)Fig.3 The number of days required for Mycelium to grow to 2.5 cm

圖4 生長(zhǎng)量變化對(duì)比Fig.4 Comparison of the growth

由圖3、圖4可知，與CK組相比，9株突變株中，5號(hào)、9號(hào)均縮短了菌絲體生長(zhǎng)至2.5 cm所需時(shí)間，所需天數(shù)為4 d，比出發(fā)菌株縮短了20%的時(shí)間；1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)均增加了所需天數(shù)，其中，3號(hào)經(jīng)6 kV誘變8 min處理后的再生菌落菌絲體所需時(shí)間最長(zhǎng)為10 d。負(fù)向突變率占77.78%。通過(guò)對(duì)比第10天、第20天、第30天的菌絲體生長(zhǎng)量變化情況發(fā)現(xiàn)，5號(hào)突變株生長(zhǎng)量較CK組相比顯著提高。

2.4 誘變處理后再生菌株生長(zhǎng)速度變化情況

電暈電場(chǎng)誘變對(duì)原生質(zhì)體再生菌株生長(zhǎng)速度的影響見(jiàn)表3，30 d內(nèi)菌株生長(zhǎng)速度變化見(jiàn)圖5。

表3 電暈電場(chǎng)誘變對(duì)原生質(zhì)體再生菌株生長(zhǎng)速度的影響Tab.3 Effect of Corona field mutation on protoplast mycelium growth speed

由表3和圖5可以看知，30 d內(nèi)，9株突變體較CK組，負(fù)變株有8株，占88.89%，正變株有1株，占11.11%，其中，5號(hào)正向突變菌株，生長(zhǎng)速度提高了13.83%。生長(zhǎng)過(guò)程中，1號(hào)突變株菌絲生長(zhǎng)較CK組密集，其余各組較稀疏。說(shuō)明蟹味菇原生質(zhì)體經(jīng)電暈電場(chǎng)8 kV誘變4 min處理可獲得有效提高菌絲體生長(zhǎng)速度的再生菌株。

圖5 30 d內(nèi)菌株生長(zhǎng)速度變化Fig.5 Change of protoplast mycelium growth speed in 30 d

3 結(jié)論與討論

電場(chǎng)是一種較常用的物理誘變方式，選用高壓電暈電場(chǎng)誘變技術(shù)對(duì)蟹味菇原生質(zhì)體進(jìn)行處理。通過(guò)不同誘變條件處理原生質(zhì)體發(fā)現(xiàn)，4 kV誘變14 min、6 kV誘變5 min、6 kV誘變8 min、6 kV誘變10 min、8 kV誘變4 min條件下可獲得再生菌落，致死率69.39%～95.92%，經(jīng)比較，高電壓短時(shí)間處理組更易獲得突變菌株。原生質(zhì)體經(jīng)8 kV誘變4 min后致死率最高，為95.92%。處理電壓為6 kV時(shí)，在試驗(yàn)范圍內(nèi)處理時(shí)間越長(zhǎng)菌絲生長(zhǎng)速度越快。

從中篩選出的9株突變菌株，經(jīng)出菇試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，電暈電場(chǎng)誘變對(duì)再生菌株的生長(zhǎng)速度產(chǎn)生了不同的影響，生長(zhǎng)速度提升的正向突變?cè)偕隇榻?jīng)8 kV誘變4 min的5號(hào)菌株，生長(zhǎng)速度比出發(fā)菌株提高13.83%，獲得了較好的誘變效果。

綜上所述，對(duì)蟹味菇原生質(zhì)體進(jìn)行電致誘變處理可行，可以獲得生長(zhǎng)速度較高的良性誘變菌株，可為蟹味菇菌種的誘變育種提供新方法。后續(xù)可以進(jìn)行誘變后營(yíng)養(yǎng)成分優(yōu)化，提高子實(shí)體產(chǎn)量的相關(guān)研究。