馮婷婷，劉 利，郭九峰，宋天磊，劉超雄

（內(nèi)蒙古大學物理科學與技術學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

蟹味菇（Hypsizygus marmoreus）屬擔子菌亞門（Basidiomycotina）傘菌目 （Agaricales）白蘑科（Tricholomataceae）玉蕈屬（Hypsizigus），又名真姬菇、玉蕈等，是外形美觀、口感獨特的食藥兼用的珍稀食用菌，具有高營養(yǎng)價值和保健價值，在市場上頗受歡迎。其子實體含有豐富的維生素、多糖、多肽、17種氨基酸和多種人體必需的礦物質[1]。工廠化規(guī)模生產(chǎn)中，蟹味菇菌絲發(fā)菌緩慢，后熟期時間較長，整個生長周期較常見食用菌長兩倍左右，同時對外界環(huán)境要求較為嚴格[2]。原生質體電致誘變研究有望篩選出提高菌株生長速度的優(yōu)質突變菌種，同時可為蟹味菇菌種改良和選育技術提供新的思路和方法，具有重要的實際應用價值。

原生質體誘變技術是菌種選育和改良的重要方法之一，具有方法簡便、周期短、一次誘變就能獲得大量突變菌株的特點。利用原生質體誘變選育優(yōu)良菌株的研究已有很多較全面的報道，在微生物食用菌菌種改良和育種領域已廣泛應用[3-9]。誘變機理為通過對底物進行物理或化學誘變劑處理，常采用紫外線、電場、離子束等方法進行誘變，使生物體細胞內(nèi)的遺傳物質發(fā)生變異，從而篩選出變異菌株，培育出新的優(yōu)質高產(chǎn)菌株。采用更為安全環(huán)保的物理誘變方法[10]。菌株原生質體為誘變材料具有誘變率高、敏感性強等優(yōu)點，利于增加其開發(fā)利用價值及優(yōu)質菌株的篩選[11]。同時，用電場誘變可以擬發(fā)基因突變，當給予不同的外加電場作用，會使菌株細胞表面所帶電荷發(fā)生變化，對細胞生長帶來不同程度的影響，進而可以篩選出良性誘變菌株及其誘變參數(shù)。

目前，國內(nèi)外研究多為對蟹味菇子實體、菌絲體誘變育種，原生質體制備技術探究的研究報道，以及以微生物為材料，利用高壓電暈電場（交流高壓電源裝置和針、板電極組成高壓電暈電場裝置，加上高壓后，在場強最大的針尖尖端處會產(chǎn)生局部放電-電暈現(xiàn)象），以此進行誘變處理。裝置進行誘變處理方面的探究[12-13]，如董先茹[14]對蟹味菇菌株離子束誘變選育進行了研究，篩選出綜合營養(yǎng)價值最高的誘變菌株。袁麗麗等[15]通過對北蟲草菌分生孢子進行高壓電暈電場誘變處理，獲得了北蟲草新的突變菌株。在蟹味菇原生質體高壓電暈電場誘變方面的研究目前尚未見報道。

試驗選取高壓電暈電場裝置，以蟹味菇原生質體為材料，通過電場誘變處理，探尋對菌株生長速度的影響及獲得優(yōu)質突變菌株的新途徑。通過篩選出菌絲體生長速度快的突變菌株，為選育蟹味菇優(yōu)質突變菌株及菌種的后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

蟹味菇（Hypsizygus marmoreus）菌株，內(nèi)蒙古大學離子束實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 加強 PDA 培養(yǎng)基

去皮馬鈴薯 200.0 g、蔗糖 10.0 g、瓊脂 10.0 g、葡萄糖 10.0 g、細菌學蛋白胨 1.6 g、酵母提取粉 1.6 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、水 1.0 L。

1.2.2 液體培養(yǎng)基

去掉上述培養(yǎng)基中的瓊脂，其余成分相同。

1.2.3 原生質體再生培養(yǎng)基

馬鈴薯 200.0 g、蔗糖 10.0 g、瓊脂 10.0 g、葡萄糖 10.0 g、細菌學蛋白胨 1.6 g、酵母提取粉 1.6 g、KH2PO41.0g、MgSO40.5g、抗生素 100.0mg、水 1.0L。

1.2.4 二級培養(yǎng)基

檸條：水：甘草粉質量比為1∶2∶0.05。

1.3 溶液的配制

1.3.1 0.6 mol·L-1甘露醇穩(wěn)滲劑

稱取10.93 g甘露醇，定容于100.00 mL容量瓶中，經(jīng)微孔過濾器過濾滅菌后備用。

1.3.2 1%溶壁酶

稱取0.1 g溶壁酶溶于10.0 mL穩(wěn)滲劑中，待完全溶解，經(jīng)微孔過濾器過濾滅菌后備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌絲培養(yǎng)

取小塊菌種接種于固體平板PDA培養(yǎng)基中，24℃避光培養(yǎng)。

1.4.2 原生質體的制備

將PDA培養(yǎng)所得菌絲體轉接至液體培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床150 r·min-1，暗培養(yǎng)7 d可得適于原生質體制備的菌絲。以0.6 mol·L-1甘露醇作為穩(wěn)滲劑，取過濾后的菌絲0.3 g，將菌絲收集于離心管中，用無菌水反復洗滌，3 500 r·min-1離心330 s，棄上清，再加入穩(wěn)滲劑洗滌3次，用濾紙吸去多余水分。加入200 μL溶壁酶，置于25℃恒溫搖床上酶解，210 min后加入300 μL穩(wěn)滲劑，3 500 r·min-1離心5 min，取上清液用無菌脫脂棉過濾，得原生質體懸浮液。取10 μL原生質體懸浮液于顯微鏡下用過血球計數(shù)板觀察計數(shù)，用穩(wěn)滲劑將原生質體懸液濃度稀釋至106個/mL。

1.4.3 原生質體電暈電場誘變及再生

置高壓電暈放電裝置于超凈臺中，誘變處理前打開紫外燈滅菌30 min，誘變時打開超凈臺風扇，避免水蒸氣對針尖放電產(chǎn)生影響[11-13]。取稀釋后原生質體懸液2 mL于直徑3.5 cm的一次性培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕搖勻，置于電暈電場，處理過程中針尖與液面間距離保持在0.7 mm，分別設置低電壓長時間、高電壓短時間組合進行處理，見表1。

表1 電暈電場誘變參數(shù)Tab.1 Mutagenesis parameter of corona electric field

如表1所示的每個處理重復3次。將誘變處理后的各組原生質體液分別取200 mL凃板于再生培養(yǎng)基中，每個處理涂3個PDA再生平板，并取未經(jīng)電場處理的原生質體液為對照組進行凃板。于24℃暗培養(yǎng)，待平板長出菌落后，計數(shù)再生菌落個數(shù)、原生質體再生率及致死率，每個試驗3個重復，取平均值。原生質體再生率（Yz，%）計算公式為：

式中：Z為再生菌落數(shù)（個）；Y為原生質體總數(shù)（個）。

致死率（S，%）計算公式為：

式中：Z為再生菌落數(shù)（個）；Y為原生質體總數(shù)（個）。

1.4.5 突變菌株的篩選

從不同電場條件處理誘變得到的突變再生菌株中挑選出9個生長較快、菌落飽滿的單個再生菌株，轉接于PDA培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)觀察。同時培養(yǎng)3個未經(jīng)誘變處理的菌株作為對照組。

1.4.6 檸條固體培養(yǎng)

轉接后的單個菌株培養(yǎng)至1個平皿，選取30支20 mm×200 mm試管，按照檸條：水：甘草粉質量比為1∶2∶0.05的比例，裝滿檸條粉壓緊，滅菌后接入菌種，包括未經(jīng)原生質體誘變處理的原始菌，每個菌接3支試管，編號、觀察并記錄各自生長速度以及菌絲體形態(tài)變化等。

2 結果與分析

2.1 原生質體的制備

通過血球計數(shù)板觀察計數(shù)，菌齡7 d、溶壁酶酶解3.5 h，獲得蟹味菇菌絲體的原生質體制備率為2.5×108個/mL。

2.2 電暈電場誘變處理蟹味菇原生質體的致死效應

經(jīng)電暈電場不同電壓、時間條件處理后蟹味菇菌絲體原生質體的再生菌落個數(shù)及致死率見表2，菌落個數(shù)對比見圖1。

表2 不同誘變條件下原生質體致死率的比較Tab.2 Comparison of the lethal rate of protoplasts under different mutagenesis conditions

由表2和圖1可知，未經(jīng)電場處理的對照組再生菌落個數(shù)明顯多于誘變處理后。當處理條件為4 kV誘變14 min、6 kV誘變5 min、6 kV誘變8 min、6 kV誘變10 min、8 kV誘變4min時可獲得再生菌落，致死率69.39%～95.92%；隨著電壓增大，致死率不斷增加。其余處理條件下致死率100%。從整體上看，高電壓短時間處理組更易獲得突變菌株，在處理條件為 8kV誘變4 min時致死率達最高95.92%。單個菌落生長速度對比見圖2。

圖2 單個菌落生長速度對比Fig.2 Comparison of single colony growth rate

由圖2可知，電壓為6 kV時，處理時間越長菌絲體越密集，菌絲生長越快，直徑越大。說明蟹味菇原生質體對于電致誘變條件的變化較為敏感。

2.3 誘變處理后再生菌株生長量變化情況

經(jīng)檸條固體培養(yǎng)試驗，各再生菌株菌絲體長至2.5 cm所需天數(shù)見圖3，菌絲體生長速度變化見圖4。

圖3 菌絲體生長至2.5 cm所需天數(shù)Fig.3 The number of days required for Mycelium to grow to 2.5 cm

圖4 生長量變化對比Fig.4 Comparison of the growth

由圖3、圖4可知，與CK組相比，9株突變株中，5號、9號均縮短了菌絲體生長至2.5 cm所需時間，所需天數(shù)為4 d，比出發(fā)菌株縮短了20%的時間；1號、2號、3號、4號、6號、7號、8號均增加了所需天數(shù)，其中，3號經(jīng)6 kV誘變8 min處理后的再生菌落菌絲體所需時間最長為10 d。負向突變率占77.78%。通過對比第10天、第20天、第30天的菌絲體生長量變化情況發(fā)現(xiàn)，5號突變株生長量較CK組相比顯著提高。

2.4 誘變處理后再生菌株生長速度變化情況

電暈電場誘變對原生質體再生菌株生長速度的影響見表3，30 d內(nèi)菌株生長速度變化見圖5。

表3 電暈電場誘變對原生質體再生菌株生長速度的影響Tab.3 Effect of Corona field mutation on protoplast mycelium growth speed

由表3和圖5可以看知，30 d內(nèi)，9株突變體較CK組，負變株有8株，占88.89%，正變株有1株，占11.11%，其中，5號正向突變菌株，生長速度提高了13.83%。生長過程中，1號突變株菌絲生長較CK組密集，其余各組較稀疏。說明蟹味菇原生質體經(jīng)電暈電場8 kV誘變4 min處理可獲得有效提高菌絲體生長速度的再生菌株。

圖5 30 d內(nèi)菌株生長速度變化Fig.5 Change of protoplast mycelium growth speed in 30 d

3 結論與討論

電場是一種較常用的物理誘變方式，選用高壓電暈電場誘變技術對蟹味菇原生質體進行處理。通過不同誘變條件處理原生質體發(fā)現(xiàn)，4 kV誘變14 min、6 kV誘變5 min、6 kV誘變8 min、6 kV誘變10 min、8 kV誘變4 min條件下可獲得再生菌落，致死率69.39%～95.92%，經(jīng)比較，高電壓短時間處理組更易獲得突變菌株。原生質體經(jīng)8 kV誘變4 min后致死率最高，為95.92%。處理電壓為6 kV時，在試驗范圍內(nèi)處理時間越長菌絲生長速度越快。

從中篩選出的9株突變菌株，經(jīng)出菇試驗發(fā)現(xiàn)，電暈電場誘變對再生菌株的生長速度產(chǎn)生了不同的影響，生長速度提升的正向突變再生菌株為經(jīng)8 kV誘變4 min的5號菌株，生長速度比出發(fā)菌株提高13.83%，獲得了較好的誘變效果。

綜上所述，對蟹味菇原生質體進行電致誘變處理可行，可以獲得生長速度較高的良性誘變菌株，可為蟹味菇菌種的誘變育種提供新方法。后續(xù)可以進行誘變后營養(yǎng)成分優(yōu)化，提高子實體產(chǎn)量的相關研究。