劉 虹，董淑英，張 程，張紅剛，鄭國(guó)華

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，山西 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院，山西 太原 030031；3.忻州市科技發(fā)展戰(zhàn)略研究所，山西 忻州 034000）

2018年～2019年，在考察山西五臺(tái)山食用菌資源時(shí)，于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)發(fā)現(xiàn)一種類似原產(chǎn)歐洲的棱柄馬鞍菌（Helvella lacunosa Afz.:Fr.）野生食用菌干品售賣，當(dāng)?shù)赝撩麨椤昂陔u冠”，已有上百年食用歷史，是當(dāng)?shù)剌^受歡迎的野生食用菌之一。隨后的野外調(diào)查中，在五臺(tái)山各處華北落葉松（Larix principisrupprechtii Mayr）林下頻繁采到該菌，部分林地能觀測(cè)到較為可觀的產(chǎn)量。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，這種形態(tài)的食用菌物種過(guò)去多被鑒定為原產(chǎn)歐洲的棱柄馬鞍菌[1]，而近期的研究顯示，生長(zhǎng)在中國(guó)北部落葉松下的類似物種經(jīng)DNA分子數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)其是不同于歐洲棱柄馬鞍菌的新物種，即假棱柄馬鞍菌（Helvella pseudolacunosa Q.Zhao&K.D.Hyde）[1]。為明確采集于五臺(tái)山地區(qū)這種食用菌的分類地位，采用形態(tài)學(xué)和DNA分子分析相結(jié)合的方法對(duì)樣本進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

子囊果標(biāo)本于2019年采自山西省中北部五臺(tái)山及周邊地區(qū)，生長(zhǎng)于華北落葉松（Larix principisrupprechtii）、華北云杉（Picea wilsonii）、油松（Pinus tabulaeformis）以及多種櫟樹(shù)（Quercus spp.）樹(shù)林中草地。新鮮標(biāo)本經(jīng)45℃烘干后分別保存于首都師范大學(xué)標(biāo)本館（BJTC）和山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所標(biāo)本館（HSA），編號(hào)為 LH627、LH823、LH864。

1.2 形態(tài)學(xué)方法

采用手持放大鏡和體視顯微鏡對(duì)子囊果樣本的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行觀察，主要包括子囊果的形狀、大小、顏色及菌柄特征等；在光學(xué)顯微鏡下觀察子囊果的顯微結(jié)構(gòu)特征。采用滅菌手術(shù)刀對(duì)菌帽、菌柄等組織進(jìn)行徒手切片，以蒸餾水或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%KOH作為浮載劑制作水封片，用Melzer氏試劑檢測(cè)子囊壁淀粉質(zhì)反應(yīng)[2]。

1.3 DNA序列測(cè)定和比對(duì)

樣本DNA提取、PCR序列擴(kuò)增以及序列測(cè)定參照Fan等[2]的方法。干標(biāo)本總DNA采用CTAB法提取后，擴(kuò)增核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)片段（internal transcribed spacer，ITS），PCR擴(kuò)增引物為 ITS1F（5′-CTTG GTCA TTTA GACG AAGTAA-3′），ITS4（5′-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3′）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)北京中科希林生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司純化、測(cè)序，獲得的序列經(jīng)手工校對(duì)后采用BLAST工具在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)。

2 結(jié)果分析

2.1 形態(tài)學(xué)結(jié)果

野外生長(zhǎng)的假棱柄馬鞍菌形態(tài)見(jiàn)圖1，市場(chǎng)上售賣的“黑雞冠”見(jiàn)圖2。

圖1 野外生長(zhǎng)的假棱柄馬鞍菌Fig.1 Helvella pseudolacunosa in situ

圖2 市場(chǎng)上售賣的“黑雞冠”Fig.2 Dried black saddle fungus in local market

由圖1、圖2所示，采集的樣本在形態(tài)學(xué)特征方面與發(fā)表的新記錄種假棱柄馬鞍菌（Helvella pseudolacunosa）的原始描述完全吻合。

2.2 ITS-DNA比對(duì)結(jié)果

山西樣本的ITS片段在NCBI上BLAST結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 山西樣本的ITS片段在NCBI上BLAST結(jié)果一覽表Tab.1 The BLAST results of ITS from Shanxi samplings in NCBI

由表1可知，提取的ITS片段與該物種模式標(biāo)本假棱柄馬鞍菌 Helvella pseudolacunosa（HKAS 87594）提取的序列 （NR155165）在覆蓋度高于95%的情況下，樣本序列和目標(biāo)序列相似度高達(dá)99%～100%。結(jié)果證實(shí)引證的采自山西五臺(tái)山的馬鞍菌樣本為假棱柄馬鞍菌。

2.3 分類學(xué)結(jié)果

假棱柄馬鞍菌Helvella pseudolacunosa Q.Zhao&K.D.Hyde,in Ariyawansa et al.,Fungal Diversity 75:142.2015。

子囊果具菌柄和菌帽，菌帽標(biāo)準(zhǔn)馬鞍形、或具有3個(gè)～4個(gè)峰狀凸起、或不規(guī)則半球形；直徑2.0 cm～6.5 cm，高 2 cm～4 cm，邊緣平展，或稍有向內(nèi)卷曲，有多個(gè)點(diǎn)與菌柄結(jié)合。子實(shí)層面（表面）近黑色至黑色，偶見(jiàn)暗灰色，干后黑色，表面平坦到呈皺褶狀或扭曲狀起伏。子層托面（背面）灰黑色或黑色，干后黑色，平坦，光滑。菌柄灰白色到灰色，偶見(jiàn)暗灰色，長(zhǎng)3 cm～10 cm，粗 1.5 cm～3.5 cm；有 5 個(gè)～8 個(gè)縱向的棱脊，棱脊鈍圓，單緣或雙緣；通常有少量橫向棱脊連接形成網(wǎng)結(jié)，內(nèi)部腔穴狀，干后白色至灰白色。中囊盤被組織為菌絲交織型，菌絲無(wú)色、薄壁、分支、分隔，直徑3 μm～5 μm。外囊盤被為角胞組織型，細(xì)胞多角形到近球形或不規(guī)則，最外側(cè)細(xì)胞每2個(gè)～4個(gè)細(xì)胞呈柵欄狀排列；末端細(xì)胞棒狀，長(zhǎng) 10 μm～25 μm，直徑 5.0 μm～12.5 μm，胞壁褐色。子囊具長(zhǎng)囊絲鉤型，圓柱形，長(zhǎng)250 μm～300 μm，直徑 12.5 μm～17.5 μm，內(nèi)含 8 個(gè)子囊孢子。子囊孢子橢圓形，無(wú)色，光滑，17.5 μm～20.0 μm × 8.5 μm～11.5 μm，內(nèi)含 1 個(gè)大油球。側(cè)絲線性，直立，分隔，近無(wú)色，直徑2.5 μm～4.0 μm，頂部棒狀，直徑 5 μm～8 μm。

3 討論與結(jié)論

DNA分子分析和形態(tài)特征比較顯示，五臺(tái)山華北落葉松林下的真菌為假棱柄馬鞍菌Helvella pseudolacunosa，隸屬于子囊菌門（Ascomycota）盤菌綱（Pezizomycetes）盤菌目 （Pezizales）馬鞍菌科（Helvellaceae）馬鞍菌屬（Helvella），外形與歐洲原產(chǎn)的棱柄馬鞍菌相似，但屬于不同的物種。形態(tài)特征方面，棱柄馬鞍菌菌帽背面顏色較淺、菌柄棱脊為銳[3]，而假棱柄馬鞍菌菌帽背面為黑色或灰黑色、菌柄棱脊為鈍，以此區(qū)分這2個(gè)物種。DNA分子系統(tǒng)發(fā)育分析在鑒定馬鞍菌屬物種的應(yīng)用中成功的解決了許多形態(tài)學(xué)特征相似物種的難題[4-7]。有研究顯示[1]，棱柄馬鞍菌和假棱柄馬鞍菌在多基因構(gòu)建的演化樹(shù)上各為獨(dú)立的分支，同樣支持其是不同物種。

假棱柄馬鞍菌是新發(fā)現(xiàn)物種，模式標(biāo)本產(chǎn)地為中國(guó)內(nèi)蒙古，生長(zhǎng)在興安落葉松 [Larix gmelinii(Rupr.)Kuzen.] 林下[1]，在五臺(tái)山地區(qū)發(fā)現(xiàn)的樣本全部產(chǎn)自華北落葉松林下，該物種與落葉松有密切的關(guān)系，有形成專一性外生菌根的可能性。

過(guò)去棱柄馬鞍菌在山西有分布記錄[8-9]，此次在山西呂梁山也采到了新的標(biāo)本。此外，一份來(lái)自山西北部樣本的DNA分析報(bào)告[10]也支持這個(gè)歐洲物種在山西的分布。然而，相比假棱柄馬鞍菌，棱柄馬鞍菌在山西是1個(gè)罕見(jiàn)的物種，生長(zhǎng)在闊葉林或針闊葉混交林下。

假棱柄馬鞍菌是五臺(tái)山地區(qū)傳統(tǒng)采食的野生食用菌之一，其形態(tài)和棱柄馬鞍菌極為相似，準(zhǔn)確鑒別需要DNA數(shù)據(jù)分析。棱柄馬鞍菌在一些專業(yè)文獻(xiàn)中被列為有毒的物種[11-12]，但亦有文獻(xiàn)將其列為食用菌并在在中國(guó)多地有采食習(xí)慣[8]。在南亞的印度喜馬拉雅地區(qū)也有食用該物種的傳統(tǒng)，且有當(dāng)?shù)貙W(xué)者研究顯示棱柄馬鞍菌具有抗氧化和修復(fù)DNA損傷的作用[13]。

研究結(jié)果證實(shí)五臺(tái)山地區(qū)華北落葉松下出產(chǎn)的當(dāng)?shù)厮追Q“黑雞冠”野生食用菌為假棱柄馬鞍菌，屬山西省新紀(jì)錄物種，同時(shí)也證實(shí)了模式產(chǎn)地為中國(guó)內(nèi)蒙古的這個(gè)物種在五臺(tái)山地區(qū)也被食用，但其營(yíng)養(yǎng)成分及藥用功效目前尚缺乏科學(xué)數(shù)據(jù)，需要進(jìn)一步研究。