◎ 李永幸，李 紅，任昭瑾

（1.商丘市食品藥品檢驗檢測中心，河南 商丘 476000；2.新鄭市食品藥品檢驗檢測中心，河南 新鄭 451100）

抗菌素的大量使用不但逐步提高了細菌的耐藥性，也同時使環(huán)境受到了嚴重的污染[1]，而環(huán)境中的食源性病菌能引起食物腐敗變質(zhì)，使人們的健康受到嚴重威脅[2]。近年來，安全性高、具有抗菌性能的低聚糖獲得相關研究人員的高度關注，例如，殼低聚糖、褐藻膠低聚糖、果膠低聚糖等[3-5]。

殼低聚糖是殼聚糖降解后的產(chǎn)物，呈淺黃色或淺棕色，理化性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于水[6]。殼低聚糖的聚合度為2 ～10、平均分子量5 ～30 kDa，是自然界中唯一含有正電荷的堿性氨基低聚糖，殼低聚糖的抑菌性能也多有報道[7-8]。果膠在自然中廣泛存在，其降解產(chǎn)物果膠低聚糖被認為具有一定的抑菌功能[9]。李托平等通過山楂果膠低聚糖與其他食品添加劑的復配對食品腐敗枯草芽孢桿菌的抑菌性進行了研究，結果表明復配后比單獨使用時的抑菌效果強[10]。褐藻膠低聚糖由褐藻酸鈉降解獲得，是一種小分子低聚糖，與大分子褐藻酸鈉相比，其分子量低，易溶于水，具有多種生物活性，在食品、生物醫(yī)藥等領域受到專家學者的高度關注[11]。其在致病菌的抑制方面也表現(xiàn)出一定的效果，YAN G L 等的試驗表明，褐藻膠低聚糖對沙門氏菌有較強的抑制作用[12]。殼聚糖及殼寡糖具有良好的抗菌活性，其抗菌機制也見于報道。Mekasha 等研究表明，殼寡糖與幾丁質(zhì)相比，其結構中的伯氨基是抗菌的主要原因[13]。黃海波等研究表明，殼寡糖具有較好的抑菌活性[14]。

本文采用不同種類的低聚糖對金黃色葡萄球菌進行抑菌試驗，并根據(jù)單因素試驗結果，利用正交設計的方法對不同種類的低聚糖進行復配，以研究復配低聚糖對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，為其在新型食品抑菌劑的研究利用上提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與主要試劑

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），購自北納生物。

殼低聚糖、果膠低聚糖（純度98%）、褐藻膠低聚糖（純度99%），均購自西安百川生物科技有限公司；營養(yǎng)肉湯、瓊脂粉，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Hve-50 型高壓滅菌鍋，購自Hirayama 公司；LRH-250 型恒溫培養(yǎng)箱，購自鄭州生元儀器有限公司；UW220H 型電子天平，購自日本島津公司。

1.3 培養(yǎng)基制備

液體培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯18 g·L-1，分裝至250 mL三角瓶中，每瓶50 mL，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中加入15 g·L-1瓊脂粉。

1.4 菌懸液的制備

菌種先于固體培養(yǎng)基上連續(xù)復壯兩次，用接種環(huán)挑取單菌落至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到菌懸液，備用。

1.5 抑菌活性測定

采用平板計數(shù)法測定低聚糖對金黃色葡萄球菌的抑菌性。以1%的乙酸為溶劑，制備成不同濃度的低聚糖抑菌液，用無菌生理鹽水將菌懸液的濃度稀釋至1×108CFU·mL-1，然后取0.1 mL 菌懸液和0.1 mL 抑菌液均勻涂布在培養(yǎng)基平板上?？瞻讟訛橐?.1 mL 溶劑替代0.1 mL 抑菌液，其余與樣品相同。每組3 個平行，平板于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄各個平板上的菌落數(shù)，計算抑菌率，抑菌率為樣品菌落數(shù)/空白樣菌落數(shù)×100%。

1.6 單因素試驗

1.6.1 殼低聚糖抑菌性的單因素試驗

調(diào)節(jié)殼低聚糖的初始濃度，依次為0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%。其他條件不變，按1.5 方法考察殼低聚糖對金黃色葡萄球菌的抑菌性能。

1.6.2 褐藻膠低聚糖抑菌性的單因素試驗

調(diào)節(jié)褐藻膠低聚糖的初始濃度，依次為0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%。其他條件不變，按1.5 方法考察褐藻膠低聚糖對金黃色葡萄球菌的抑菌性能。

1.6.3 果膠低聚糖抑菌性的單因素試驗

調(diào)節(jié)果膠低聚糖的初始濃度，依次為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%和0.7%。其他條件不變，按1.5 方法考察果膠低聚糖對金黃色葡萄球菌的抑菌性能。

1.7 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，應用正交設計助手Ⅱv3.1對低聚糖進行復配，進行3 因素3 水平正交試驗，水平因素見表1。

表1 正交試驗因素水平表

2 結果與分析

2.1 不同濃度殼低聚糖對金黃色葡萄球菌的抑菌效果

由圖1 可知，隨著殼低聚糖濃度的增大，樣品對金黃色葡萄球菌的抑菌率逐漸增大，其中殼低聚糖濃度在0.2%～0.4%時，增速變緩，在0.4%時抑菌率達到85.5%。

2.2 不同濃度褐藻膠低聚糖對金黃色葡萄球菌的抑菌效果

由圖2 可知，褐藻膠低聚糖對金黃色葡萄球菌的抑制率隨其濃度的增加而提高，濃度為0.05%～0.3%時，抑菌率增速明顯。當濃度為0.5%時，抑菌率最大，為77.5%。

圖1 不同濃度殼低聚糖的抑菌率圖

圖2 不同濃度對褐藻膠低聚糖的抑菌率影響圖

2.3 不同濃度果膠低聚糖對金黃色葡萄球菌的抑菌效果

果膠來源廣泛，其分解產(chǎn)物果膠低聚糖具有一定的抑菌功能。王江浪對蘋果果膠低聚糖抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的效果進行了研究，結果表明其對這兩種細菌都有較好的抑制作用[15]。本實驗對不同濃度的果膠低聚糖抑制金黃色葡萄糖球菌的效果進行研究，結果如圖3 所示。

圖3 不同濃度果膠低聚糖的抑菌率圖

由圖3 可知，高濃度的果膠低聚糖比低濃度的抑菌效果強，濃度0.7%時，抑菌率達到82.4%，表明金黃色葡萄球菌對高濃度的果膠低聚糖更敏感。

2.4 低聚糖抑菌性的正交試驗

表2 及表3 表明，3 種因素對金黃色葡萄球菌的抑菌性的主次順序為A ＞B ＞C，即殼低聚糖濃度對金黃色葡萄糖球菌的抑菌性影響最大，其次為褐藻膠低聚糖濃度，果膠低聚糖濃度影響最小，且殼低聚糖濃度的影響顯著，其最優(yōu)組合為A3B3C3。在正交試驗的最優(yōu)組合下進行抑菌試驗，復配低聚糖對金黃色葡萄球菌的抑菌率為95.2%±0.6%，高于正交表中組合，表明其最佳復配濃度為：殼低聚糖0.2%，褐藻膠低聚糖0.3%，果膠低聚糖0.5%。

表2 正交試驗設計與結果分析表

表3 方差分析表

3 結論

本實驗通過單因素及正交設計的方法對低聚糖濃度進行優(yōu)化，得到最佳濃度，并對該濃度進行驗證，其最佳濃度組合為：殼低聚糖0.2%，褐藻膠低聚糖0.3%，果膠低聚糖0.5%，抑菌率達到95.2%±0.6%。