馬愛萍，馬國(guó)寧，張海紅，劉 倩，馮曉榮，張玉春，王明祿

(1.甘肅省紅十字血液中心輸血研究所,甘肅 蘭州 730070；2.中源協(xié)和細(xì)胞基因工程有限公司甘肅分公司，甘肅 蘭州 730070)

血小板輸注是臨床上重要的支持療法，常用于預(yù)防和治療血小板減少或血小板功能缺陷患者的出血。然而患者在多次輸注血小板后，可產(chǎn)生血小板相關(guān)抗體，導(dǎo)致血小板輸注無效?！杜R床輸血技術(shù)規(guī)范(2019版)》(征求意見稿)第4.5.2條中明確規(guī)定“輸注血小板時(shí)宜進(jìn)行血小板抗體篩查，抗體陽(yáng)性時(shí)申請(qǐng)配合性血小板輸注?！睘榱祟A(yù)防血小板輸注無效，保證患者的輸血安全，節(jié)約寶貴的血液資源，指導(dǎo)臨床合理用血，我們對(duì)93名孕產(chǎn)婦、166名患者、90名機(jī)采血小板捐獻(xiàn)者、80份臍血樣本進(jìn)行了血小板抗體篩查，以分析不同人群血小板抗體陽(yáng)性率及其影響因素。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)對(duì)象

選取甘肅省紅十字血液中心輸血研究所接收的166份患者標(biāo)本，這些患者是臨床送檢的免疫性血液病患者，主要是多次輸血的溶血性貧血和自身免疫性疾病、疑難配血、血小板輸注無效(platelet transfusion refractoriness,PTA)等患者標(biāo)本。93名孕產(chǎn)婦主要是RhD陰性的多胎次孕產(chǎn)婦。血液中心50人份無輸血史和妊娠史的機(jī)采血小板捐獻(xiàn)者的標(biāo)本。80份臍血來自中源協(xié)和細(xì)胞基因工程有限公司甘肅臍血庫(kù)冷凍保存的臍血血漿，抽取首胎產(chǎn)婦的臍血。

1.2 檢測(cè)試劑

血小板抗體篩查和交叉配型試劑盒(固相凝集法)主要由廣東睿基生物公司提供，其他的對(duì)照試劑有荷蘭Sanquin和長(zhǎng)春博德同類產(chǎn)品。

1.3 操作方法

1.3.1 檢測(cè)前準(zhǔn)備

(1)患者樣本:5mL患者紅頭無添加劑管3000轉(zhuǎn)離心10分鐘；

(2)機(jī)采血小板樣本稀釋5倍，也可以取5mL獻(xiàn)血者EDTA-K2抗凝血，200g離心10分鐘；

(3)取出試劑室溫放置半小時(shí)。

1.3.2 樣本檢測(cè)

(1)取出兩條微孔板條，標(biāo)記陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、患者抗體篩查孔；

(2)在陰陽(yáng)性對(duì)照和患者抗篩孔中加入50微升PC(抗篩血小板)；

(3)50RCF離心5分鐘使血小板固定到微孔板表面，用PBS/TWeen洗板3次去掉未結(jié)合的；

(4)加入2滴(100微升)紫色LISS液，在陰陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰陽(yáng)性對(duì)照，在抗篩孔中加入患者血清50微升封板膜封板，輕輕混勻；

(5)置37℃孵育30分鐘，然后用PBS/TWeen洗板5次，立即每孔加入1滴抗人IgG試劑，然后加入指示紅細(xì)胞，輕輕震蕩后，立即200g離心5分鐘。

1.4 結(jié)果判讀

陰性反應(yīng)：紅細(xì)胞在微孔板底形成小小的細(xì)胞扣，表明血清中不存在血小板抗體和人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)抗體。

強(qiáng)陽(yáng)性或弱陽(yáng)性反應(yīng)：紅細(xì)胞在微孔底部形成均勻分布的一層紅細(xì)胞，表明血清中存在血小板抗體或HLA抗體。強(qiáng)陽(yáng)性和弱陽(yáng)性判斷是根據(jù)實(shí)際工作進(jìn)行細(xì)分的。強(qiáng)陽(yáng)性指紅細(xì)胞占底部園一半以上的面積，弱陽(yáng)性指紅細(xì)胞占底部園一半以下的面積。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以頻率及百分率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.0083(0.05/6)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同人群的血小板抗體檢測(cè)結(jié)果見表1

表1 不同人群的血小板抗體檢測(cè)結(jié)果

166份血液患者的血小板抗篩強(qiáng)陽(yáng)性率為(46/166)27.7%，弱陽(yáng)性率為22.3%，總陽(yáng)性率為50.0%。93名2胎以上的RHD陰性孕產(chǎn)婦血小板抗篩強(qiáng)陽(yáng)性率為(22/93)23.7%，弱陽(yáng)性率為(13/93)14.0%，總的陽(yáng)性率為(35/93)37.7%。80名臍血的血小板抗體弱陽(yáng)性率為(2/80)2.5%。50份血小板獻(xiàn)血者的血小板抗體陽(yáng)性率為0%。

2.2 不同組血小板抗體總陽(yáng)性率兩兩比較結(jié)果

按檢驗(yàn)水準(zhǔn)α’=0.0083，臍血組、血小板捐獻(xiàn)者組的血小板陽(yáng)性率均有差別；RhD陰性孕產(chǎn)婦組與臍血組、血小板捐獻(xiàn)者組的血小板陽(yáng)性率均有差別。但還不能認(rèn)為免疫血液病患組與RhD陰性孕產(chǎn)婦組的陽(yáng)性率有差別，也不能認(rèn)為血小板捐獻(xiàn)者組與臍血組的陽(yáng)性率有差別。見表2。

表2 不同組血小板抗體總陽(yáng)性率兩兩比較

3 討論

血小板參與維持血管完整性，在止血及血栓形成、固有免疫應(yīng)答和淋巴系統(tǒng)的發(fā)育等方面有重要作用。在人體生理或疾病過程中，血小板主要通過聚集、黏附以及釋放止血因子、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等來發(fā)揮作用。但血小板具有復(fù)雜的抗原系統(tǒng)，一類是ABO血型系統(tǒng)抗原和人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)等血小板相關(guān)抗原，另一類是血小板特異性抗原(human platelet antigen，HPA)。反復(fù)輸血及多次妊娠者容易產(chǎn)生血小板抗體，引起PTR(platlet transfusion refractoriness,血小板輸注無效)、FNAIT(fetal and neonatal alloimmune thrombocytopenia，胎兒和新生兒同種免疫性血小板減少癥)等疾病，以及NHTR(non-hemolytic transfusion reaction，非溶血性發(fā)熱反應(yīng))、PTP(post-transfusion purpura，輸血后紫癜等輸血不良反應(yīng)[1]。

本文中的臍血是正常孕產(chǎn)婦臍血血漿，產(chǎn)婦生產(chǎn)胎次均為1胎，由于IGG抗體能夠通過胎盤屏障，所以臍血中的血小板抗體能夠代表產(chǎn)婦體內(nèi)的抗體情況，說明正常產(chǎn)婦的血小板抗體陽(yáng)性率約為2.5%，而RhD陰性產(chǎn)婦組是2～5次的多胎次或有流產(chǎn)史的產(chǎn)婦，其血小板抗體陽(yáng)性率為37.7%。RhD陰性產(chǎn)婦組與臍血組、血小板捐獻(xiàn)者組的抗體陽(yáng)性率有顯著性差異，P<0.0083,說明隨著妊娠次數(shù)增加，血小板抗體陽(yáng)性率也在增高，與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致[2-5]，進(jìn)一步證實(shí)了血小板抗體與妊娠次數(shù)和流產(chǎn)的相關(guān)性。

本文中的166名免疫性血液病患者大部分有多次輸血史，輸注過的血液產(chǎn)品包括血小板、紅細(xì)胞和血漿等。這組人群血小板抗體陽(yáng)性率與血小板捐獻(xiàn)者、臍血組比較的抗體陽(yáng)性率有顯著性差異，P<0.0083，說明隨著輸血次數(shù)的增多，血小板抗體陽(yáng)性率也增大。這與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道相一致[6-7]。

本文中的機(jī)采血小板獻(xiàn)血者主要是無妊娠史和輸血史的年輕人，所以未檢出血小板抗體，進(jìn)一步印證了血小板抗體產(chǎn)生與妊娠和輸血的關(guān)系。獻(xiàn)血者血小板抗體的篩查，有助于評(píng)估機(jī)采血小板的安全性。

通過對(duì)不同人群開展血小板抗體檢測(cè)，說明血小板抗體產(chǎn)生的主要誘因是多次妊娠和多次輸血，這為我們落實(shí)新的臨床技術(shù)規(guī)范的要求做好了準(zhǔn)備，也有助于臨床有針對(duì)性地對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)人群開展血小板抗體檢測(cè)。血小板抗體陽(yáng)性患者需要輸注血小板時(shí)進(jìn)行交叉配型，選擇配合型血小板進(jìn)行輸注，從而提高臨床血小板療效。