馬駿,王然,劉碩,王欣,段旭陽,陳晶,楊思宇,王麗,劉慧婷,范釗偉,崔玉東
(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院,大慶 163319)
奶牛乳腺炎是奶牛最常見的疾病,嚴(yán)重危害奶牛健康和奶業(yè)的發(fā)展。奶牛乳腺炎主要是由細(xì)菌乳腺內(nèi)感染(IMI)引起的,而金黃色葡萄球菌和鏈球菌是引起奶牛乳腺炎的常見重要病原體[1-2]。盡管在世界各地的一些奶牛場采取了乳腺炎控制計劃,但在過去的幾十年中對奶牛乳腺炎仍然以抗生素治療為主[3]。然而,隨著金黃色葡萄球菌和鏈球菌抗生素耐藥菌株的大量增加以及消費者對無抗生素牛奶的需求,使用抗生素治療和控制奶牛乳腺炎受到嚴(yán)格限制。因此,研究和開發(fā)有效的疫苗來預(yù)防奶牛乳腺感染越來越引起人們的關(guān)注。目前人們研究奶牛乳腺炎疫苗主要是亞單位疫苗,并且多種抗原蛋白融合誘導(dǎo)的免疫保護作用優(yōu)于單一抗原蛋白[4]。奶牛乳腺炎由多種致病菌引起,單一抗原亞單位疫苗無法滿足奶牛乳腺炎免疫預(yù)防需要,奶牛乳腺炎疫苗應(yīng)當(dāng)包含多種致病菌的抗原。但是由于表達抗原蛋白的載體容量有限,無法同時表達多個抗原蛋白。表位是有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的基本成分,一般T 細(xì)胞表位為8~16 個氨基酸的線性短肽,線性B 細(xì)胞表位多為6~9 個氨基酸短肽。表位串聯(lián)而制成的表位疫苗具有能夠容納多個抗原表位、預(yù)防多種病原感染的優(yōu)勢,且具有安全、穩(wěn)定、高產(chǎn)、可以選擇性地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答類型[5]。以往研究表明[6-7],金黃色葡萄球菌纖連蛋白結(jié)合蛋白A(FnBPA)參與金黃色葡萄球菌的早期黏附,能夠誘導(dǎo)良好的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答;另據(jù)報道[8-9],使用重組的停乳鏈球菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶C(GapC)進行免疫,可以對停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌提供交叉保護。進一步研究表明[10],GapC 蛋白的 1 至 150 位的氨基酸序列(GapC1-150)可誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生與GapC 全蛋白相同的抗無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌的免疫應(yīng)答和免疫保護作用。通過生物信息學(xué)分析顯示,這三種鏈球菌的GapC 蛋白的1 至150 位氨基酸同源性高達94%。
為了探索能夠誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答,且能夠同時預(yù)防金黃色葡萄球菌和鏈球菌引起的奶牛乳腺炎的表位疫苗,前期以金黃色葡萄球菌FnBPA的 CD4+T 細(xì)胞表位 FnBPA488-505和 B 細(xì)胞表位FnBPA352-364、FnBPA763-772構(gòu)建了多表位疫苗 FTB1B2;以停乳鏈球菌GapC 的CD4+T 細(xì)胞表位GapC63-77和B 細(xì)胞表位 GapC30-36、GapC97-103構(gòu)建了多表位疫苗GTB1B2,并證明這兩個多表位疫苗均能誘導(dǎo)良好的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答,且能抑制金黃色葡萄球菌及停乳鏈球菌在免疫小鼠各器官的定殖量。實驗將表位疫苗FTB1B2 和GTB1B2 串聯(lián),通過小鼠模型評估多表位疫苗的免疫原性和保護效果,為設(shè)計研究預(yù)防金黃色葡萄球菌和鏈球菌感染的通用型奶牛乳腺炎多表位疫苗提供參考。
金黃色葡萄球菌Newman、停乳鏈球菌LS0312、重組菌株 BL21(DE3)/pGEX-6p-1(+)/FTB1B2、BL21(DE3)/pGEX-p-1(+)/GTB1B2 、BL21(DE3)/pGEX-p-1(+)/FT、BL21(DE3)/pGEX-p-1(+)/GT 由實驗室構(gòu)建并保存。6~8 周齡雌性SPF BALB/c 小鼠購遼寧長生生物技術(shù)有限公司。
限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ購自TaKaRa 寶生物工程有限公司;Goat anti-mouse IgG-HRP 及弗氏佐劑購自Sigma 公司;紅細(xì)胞裂解液購自碧云天生物公司;CCK-8 購自同仁化學(xué)研究所;RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)及青霉素-鏈霉素雙抗購自GIBCO 公司;GST-binding-resin 純化柱購自天地人和生物科技有限公司;小鼠IFN-γ、IL-4 和IL-17A預(yù)包被ELISA 檢測試劑盒購自北京達科為生物有限公司。
1.3.1 表位疫苗的設(shè)計
實驗室前期篩選了FnBPA 的一個CD4+T 細(xì)胞表位FnBPA488-505(FT)和GapC 的一個CD4+T 細(xì)胞表位GapC63-77(GT),并且實驗已經(jīng)構(gòu)建了FnBPA 多表位肽FTB1B2 和GapC 多表位肽GTB1B2。使用GSGSGS 作為蛋白 Linker,串聯(lián) FT、GT,構(gòu)成 FGT 多肽;串聯(lián)FTB1B2、GTB1B2,構(gòu)成FG 多肽。使用DNA-works 將表位肽的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成核苷酸序列并進行密碼子優(yōu)化。在序列的上下游分別加入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點。由吉林省庫美生物科技有限公司合成基因。
1.3.2 重組表位原核表達載體的鑒定
將合成含有目的基因的重組質(zhì)粒分別命名為pGEX-6P-1(+)-FGT、pGEX-6P-1(+)-FG。將合成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中,提取重組質(zhì)粒后,使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對含有目的基因的重組質(zhì)粒37 ℃酶切3 h,酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。將鑒定正確的重組菌株等體積加到50%甘油溶液中,混勻后凍存于-80 ℃。
1.3.3 重組表位的表達純化及多肽的合成
活化重組菌株 BL21(DE3)/pGEX-6P-1(+)/FGT、BL21(DE3)/pGEX-6P-1(+)/FG、BL21(DE3)/pGEX-6P-1(+)/FT、BL21(DE3)/pGEX-6P-1(+)/GT、BL21(DE3)/pGEX-6P-1(+)/FTB1B2 和 BL21(DE3)/pGEX-6P-1(+)/GTB1B2,1∶100 轉(zhuǎn)接至 Amp+LB 培養(yǎng)基,培養(yǎng)至 OD600為 0.6~0.8,加入終濃度 1 mM·mL-1的IPTG,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,超聲破碎后,使用GST-binding-resin 純化柱純化重組蛋白并進行SDS-PAGE 分析,將目標(biāo)蛋白裝到透析袋中,于PBS 中4 ℃過夜透析,將蛋白稀釋或濃縮至 1 mg·mL-1,放在-80 ℃冰箱備用。由上海楚肽生物有限公司合成FT、GT、FTB1B2和GTB1B2 多肽。
1.3.4 小鼠免疫接種及攻毒
將6~8 周齡的雌性BALB/c 小鼠隨機分為8 組,每 組 10 只 小 鼠 。 純 化 的 FT、GT、FGT、GTB1B2、FTB1B2、FG 和GST 蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混勻乳化,對小鼠后腿部肌肉注射免疫接種,免疫劑量為100 μg·只-1。初次免疫后3 周,將蛋白與弗氏不完全佐劑混勻乳化,免疫接種小鼠。加強免疫后2周,每組選取3 只小鼠腔注射1×108CFU 的停乳鏈球菌LS0312;每組選取3 只小鼠腹腔注射2×109CFU 的金黃色葡萄球菌Newman,攻毒后48 h 檢測小鼠各組織臟器的細(xì)菌定殖情況。
1.3.5 分離小鼠的脾淋巴細(xì)胞
加強免疫后一周,每組取3 只,無菌取脾臟,在200 目尼龍網(wǎng)上研磨脾臟,使用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞,收集脾淋巴細(xì)胞,進行細(xì)胞計數(shù),并稀釋成1×106mL-1備用。
1.3.6 檢測多表位疫苗誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖
將分離得到的小鼠脾淋巴細(xì)胞加入到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔 100 μL 細(xì)胞,分別用 FT 與 GT 混合物、FTB1B2 多肽和 GTB1B2 多肽,2 μg·孔-1刺激各免疫組小鼠的脾淋巴細(xì)胞,以5 μg ConA 作為陽性對照,以無菌PBS 刺激作為陰性對照,以完全培養(yǎng)基作為空白對照。37 ℃,5% CO2培養(yǎng)48 h 后,每孔加入10 μL CCK-8 試劑,混勻后繼續(xù)培養(yǎng)3 h。使用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處樣品的吸光度。
1.3.7 檢測多表位疫苗誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞因子水平
將分離得到的小鼠脾淋巴細(xì)胞加入到6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔2 mL 細(xì)胞,分別用FTB1B2 多肽、GTB1B2 多肽刺激各免疫組小鼠的脾淋巴細(xì)胞,每孔40 μg,以無菌PBS 緩沖液刺激作為陰性對照。37 ℃,5% CO2培養(yǎng)48 h 后,4 ℃離心收集上清。使用預(yù)包被的小鼠IFN-γ ELISA 檢測試劑盒、鼠IFN-γ ELISA檢測試劑盒和鼠IFN-γ ELISA 檢測試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IFN-γ、IL-4 和IL-17A 的含量。
1.3.8 間接ELISA 法檢測多表位疫苗誘導(dǎo)的血清IgG 水平
加強免疫后2 周,每組取3 只小鼠,摘除眼球取血,使用無菌EP 管收集血液,血液37 ℃靜置1 h 后4 ℃過夜,次日5 000 g 離心30 min,吸出上層血清。以GTB1B2 多肽和FTB1B2 多肽作為檢測抗原,使用間接ELISA 法檢測各免疫組小鼠血清中的IgG 水平。
1.3.9 檢測免疫小鼠器官中的細(xì)菌定殖
使用Newman 菌株和LS0312 菌株攻毒48 h 后,每組取3 只小鼠,摘除并研磨小鼠的肝臟、脾臟、肺臟和腎臟,連續(xù)10 倍比稀釋,取50 μL 涂布于TSA 或BHI 固體培養(yǎng)基平皿,37 ℃培養(yǎng)24 h,菌落計數(shù)并計算小鼠各臟器的金黃色葡萄球菌和停乳鏈球菌定殖數(shù)。
1.3.10 統(tǒng)計分析
使用OriginPro 8.0 和SPSS 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行了分析,“ *”表示 P<0.05,“ **”表示 P<0.01,“***”表示 P<0.001。
對合成的含有FGT、FG 目的基因的重組質(zhì)粒進行提取,使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對提取的質(zhì)粒進行酶切鑒定,酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1 所示,分別在126 bp 和312 bp 處可見目的條帶。
圖1 多表位肽質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 Identification of multi-epitope peptide plasmids by double digestion
重組菌株 BL21(DE3)/pGEX-6P-1(+)/FGT、BL21(DE3)/pGEX-6P-1(+)/FG 經(jīng) IPTG 誘導(dǎo) 4 h,使用GST 標(biāo)簽蛋白純化柱純化后,進行SDS-PAGE 分析。結(jié)果如圖2 所示,超聲后大部分重組蛋白保留在上清液中,在31 KDa 左右處可見重組FGT 蛋白,36 KDa處發(fā)現(xiàn)重組的FG 蛋白,與預(yù)期蛋白大小基本一致。
圖2 重組表位蛋白的表達與純化的SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed and purified multi-epitope peptides
為了評價多表位疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力,對小鼠淋巴細(xì)胞的增殖進行檢測。加強免疫后一周,分離各免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞,分別用FT 與GT混合物、FTB1B2 多肽、GTB1B2 多肽刺激后,使用CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖。結(jié)果如圖3 所示,F(xiàn)TB1B2多肽能刺激FT、FGT、FTB1B2 和FG 免疫組小鼠淋巴細(xì)胞增殖;GTB1B2 多肽能刺激 GT、FGT、GTB1B2 和FG 組小鼠淋巴細(xì)胞增殖;FT 和GT 混合肽能同時刺激 FT、GT、FGT、GTB1B2、FTB1B2 和 FG 免疫組小鼠淋巴細(xì)胞的增殖,并且GT 和FGT 免疫組淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)顯著高于其他表位疫苗組(P<0.05)。
為了鑒定多表位疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的水平及類型,通過間接ELISA 方法檢測各免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞在體外受到FTB1B2 和GTB1B2 多肽刺激后分泌的細(xì)胞因子水平。結(jié)果如圖4 所示,受到FTB1B2 刺激后,F(xiàn)T 和 FGT 免疫組分泌的 IFN-γ 和IL-17A 水平顯著高于 GST 對照組,F(xiàn)TB1B2 和 FG 免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ、IL-4 和IL-17A水平高于其他免疫組(P<0.01);各免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞受到GTB1B2 多肽刺激后,GT 和FGT 組分泌的IFN-γ 和 IL-17A 水平顯著高于 GST 對照組,GTB1B2 和 FG 免疫組分泌的 IFN-γ、IL-4 和 IL-17A均顯著高于其他免疫組(P<0.01)。
圖3 表位疫苗誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果Fig.3 Epitope vaccine-induced lymphocyte proliferation results
圖4 多表位疫苗誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞因子水平Fig.4 Epitope vaccine-induced lymphocyte proliferation results
為了分析表位疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的特異性IgG水平,加強免疫后兩周,取各免疫組小鼠血清,分別以FTB1B2 和GTB1B2 多肽作為包被抗原檢測IgG抗體水平。小鼠血清的特異性IgG 抗體水平如圖5所示,F(xiàn)G 免疫組小鼠血清中的FTB1B2 抗體水平低于FTB1B2 組,但是顯著高于其他免疫組:FG 免疫組小鼠血清中的GTB1B2 抗體水平顯著高于其他免疫組但低于GTB1B2 組。
圖5 表位疫苗誘導(dǎo)的血清特異性IgG 抗體水平Fig.5 Specific IgG antibody levels in sera induced by epitope-vaccines
為了評價表位疫苗免疫接種后產(chǎn)生的免疫保護作用,小鼠加強免疫接種后兩周,分別以最大耐受劑量的 S.dysgalactiae LS0312 和 S.aureus Newman 對小鼠進行腹腔攻毒,48 h 后通過多器官細(xì)菌定殖數(shù)來評價表位疫苗的免疫保護作用。從金黃色葡萄球菌定殖情況來看,F(xiàn)T、FGT、FTB1B2 和 FG 免疫組小鼠各臟器中的細(xì)菌定殖數(shù)顯著低于GST 對照組,F(xiàn)G 免疫組小鼠臟器中的細(xì)菌定殖數(shù)顯著低于FT 和FGT免疫組但高于 FTB1B2 免疫組(P<0.001);從 S.dysgalactiae 定殖情況看,GTB1B2 和FG 免疫組小鼠各臟器中的S.dysgalactiae 定殖數(shù)顯著低于其他免疫組,而FG 免疫組小鼠臟器中的細(xì)菌定殖數(shù)顯著高于GTB1B2 免疫組(P<0.001)。盡管 FG 表位疫苗抑制小鼠臟器中S.aureus 或S.dysgalactiae 定殖效果要低于FTB1B2 或GTB1B2,但是FG 表位疫苗能夠同時對金黃色葡萄球菌和S.dysgalactiae 起到抑制作用。結(jié)果見圖6。
圖6 免疫小鼠器官中的S.aureus 和S.dysgalactiae 定殖結(jié)果Fig.6 Colonization of S.aureus and S.dysgalactiae in the immunized mouse organs
能夠引起奶牛乳腺炎的致病菌種類繁多,但金黃色葡萄球菌和鏈球菌(主要是無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌)感染所占奶牛乳腺炎病例比例很高,可高達75%[11]。因此,預(yù)防奶牛乳腺炎的理想疫苗應(yīng)該能夠同時預(yù)防金黃色葡萄球菌感染和鏈球菌感染。但是由于表達載體容量限制,無法同時表達多個抗原蛋白。選用兩種病原菌的多個抗原研究制備奶牛乳腺炎多抗原表位疫苗對預(yù)防金黃色葡萄球菌感染或鏈球菌感染無疑具有重要意義。
以往研究表明[12-15],細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗金黃色葡萄球菌與鏈球菌感染中發(fā)揮著重要的作用,且在表位疫苗構(gòu)建中加入T 細(xì)胞表位則可以提高表位疫苗誘導(dǎo)的免疫保護作用。因此,在研究前期研究金黃色葡萄球菌FnBPA 的多表位疫苗FTB1B2 和停乳鏈球菌GapC 的多表位疫苗GTB1B2 時,就分別引入了CD4+T 細(xì)胞表位,并證明了CD4+T 細(xì)胞表位能夠提高多表位疫苗的效果。研究進一步將前期構(gòu)建的多表位疫苗 FTB1B2 和 GTB1B2 用 GSGSGS 柔性 Linker進行串聯(lián)制備了新的多表位疫苗FG。同時還構(gòu)建了由 FnBPA CD4+T 細(xì)胞表位FT 和GapC CD4+T 細(xì)胞表位GT 構(gòu)成的CD4+T 細(xì)胞表位疫苗FGT 作為對照。從細(xì)胞因子結(jié)果可以看出,CD4+T 細(xì)胞表位疫苗FGT 能誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生IFN-γ 和IL-17A,即TH1和TH17 型應(yīng)答,但誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答能力并未隨著T 細(xì)胞表位數(shù)量的增加而增強。FTB1B2、GTB1B2 和FG 免疫小鼠后都能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的IFN-γ、IL-4 和IL-17A,盡管FG 誘導(dǎo)的細(xì)胞因子水平要低于FTB1B2 和GTB1B2,但FG 能誘導(dǎo)針對兩種病原菌抗原表位肽的細(xì)胞免疫應(yīng)答。體液免疫應(yīng)答在抗金黃色葡萄球菌與鏈球菌感染中同樣不可或缺,表位疫苗的IgG 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),F(xiàn)G 免疫組血清中的FTB1B2 抗體水平或GTB1B2 抗體水平低于FTB1B2和GTB1B2 免疫組,但是FG 能同時誘導(dǎo)產(chǎn)生針對兩種表位肽的IgG 抗體。FGT 與 FT、GT 相比,抑制金黃色葡萄球菌或停乳鏈球菌定殖的效果基本一致,并顯著低于其他表位疫苗免疫組。FG 表位疫苗誘導(dǎo)小鼠抑制金黃色葡萄球菌或停乳鏈球菌器官定殖作用弱于FTB1B2 或GTB1B2 表位疫苗,但是FG 表位疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠同時抑制金黃色葡萄球菌和停乳鏈球菌器官定殖作用。以上說明多表位疫苗FG 誘導(dǎo)小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答以及抑制細(xì)菌在內(nèi)臟器官定殖作用均弱于多表位疫苗FTB1B2或GTB1B2,但一個多表位疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對金黃色葡萄球菌和停乳鏈球菌兩種病原的免疫預(yù)防作用。
大多數(shù)的表位疫苗設(shè)計都是將T 細(xì)胞表位放在多表位疫苗的N 端,將B 細(xì)胞表位放在C 端[16-17],此前構(gòu)建好的多表位疫苗FTB1B2 與GTB1B2 都是將CD4+T 細(xì)胞表位放在了各自的N 端。而實驗是將FTB1B2 與GTB1B2 直接以Linker 按此順序串聯(lián),并沒有在進一步優(yōu)化T 細(xì)胞表位和B 細(xì)胞表位的順序。再有,報道的多表位疫苗常包含 3~4 個表位[16,18],而研究的FG 由6 個表位構(gòu)成,從結(jié)果可以看出,隨著抗原表位的增多,表位疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答和免疫保護作用會顯著下降。因此,表位數(shù)量、各表位的順序、表位間的連接以及表位的性質(zhì)等是否會對其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答和免疫保護作用造成了一定的影響有待進一步研究。研究對小鼠進行了兩次免疫,增加免疫次數(shù)是否會提高免疫保護效果值得進一步研究。
綜上所述,研究構(gòu)建的FG 多表位能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較好的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答,并能同時較好地抑制攻毒小鼠器官中金黃色葡萄球菌和停乳鏈球菌的定殖。