張萌萌，李天陽，姜寧，張愛忠

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院/黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，大慶 163319）

隨著抗生素的禁用以及蛋白質(zhì)飼料的緊缺，尋找新的抗生素替代品以及開發(fā)新的蛋白質(zhì)飼料生產(chǎn)方式成為研究的熱點，利用微生物進(jìn)行飼料的發(fā)酵可以產(chǎn)生較多的微生物代謝小分子以及高蛋白產(chǎn)品[1]。固態(tài)發(fā)酵就是一種常用的微生物生產(chǎn)高蛋白飼料的手段[2]。原料經(jīng)過微生物進(jìn)行的固態(tài)發(fā)酵后，其含有的多糖類化合物、脂肪、蛋白質(zhì)等一些大分子物質(zhì)代謝為可以直接吸收運(yùn)用的小分子物質(zhì)，同時可以在一定程度上降低原料中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，使發(fā)酵后的原料更易被動物機(jī)體消化和吸收[3]。劉紀(jì)成等[4]采用復(fù)合菌劑以花生秸稈為底料進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵發(fā)現(xiàn)粗蛋白含量提高了53.39%，粗灰分和粗纖維分別降低了20.10%和57.97%。張仲卿等[5]在簡單破碎的玉米秸稈上接種混合真菌后發(fā)現(xiàn)纖維素和木質(zhì)素含量普遍下降，分別降低了36.80%和28.87%。申春莉等[6]利用靈芝菌絲發(fā)酵豆渣發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白和氨基酸態(tài)氮由發(fā)酵前 2.03 mg·g-1和 1.16 mg·g-1顯著上升到11.01 mg·g-1和 9.88 mg·g-1。固態(tài)發(fā)酵還可以生產(chǎn)生物活性次級代謝產(chǎn)物，例如：激素、生物堿、酶等[7]。劉瀟等[8]使用枯草芽孢桿菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵后經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)核桃粕多肽含量可達(dá)243.97 mg·g-1。錢靜亞等[9]采用米曲霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵后檢測到極具活性的木質(zhì)素降解酶，其含量可以達(dá)到2.08 U·g-1ds。

近些年來，利用酵母菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵改善飼料品質(zhì)的研究已有較多的報道，Mandal 等[10]利用魚腸中分離的畢赤酵母菌（GU939629）進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵單寧酶含量可達(dá)0.82±0.024 U·g-1ds，單寧含量降低94.10%。孫宏等[11]利用釀酒酵母進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵后經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)原料中粗蛋白、總酚、維生素B2和低分子量肽含量顯著提高。雖有較多的研究證實酵母菌具有改善飼料品質(zhì)的功能，但其發(fā)酵底物和發(fā)酵的工藝不盡相同，致使產(chǎn)品的質(zhì)量各不相同，使用效果參差不齊，生產(chǎn)上的差異嚴(yán)重制約了酵母類添加劑的推廣和實際的應(yīng)用。因此，試驗選用含抗菌肽CC31 畢赤酵母工程菌為試驗菌種，以豆粕和麥麩為發(fā)酵底物，以小分子蛋白質(zhì)為評價指數(shù)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時擬合小分子蛋白濃度（Y）與接種量（X1）、含水量（X2）的方程，以期為酵母菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)高功能性蛋白含量的飼料提供合理的技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵原料和菌種

豆粕、麥麩均購自黑龍江大慶市大慶禾豐八一農(nóng)大動物科技有限公司。

含抗菌肽CC31 巴斯德畢赤酵母重組工程菌為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物營養(yǎng)研究所保存。根據(jù)雜合抗菌肽的分子設(shè)計原理，實驗室利用家蠅抗菌肽Cec Md 和林蛙抗菌肽Chensirin 的序列作為親本肽序列，通過消減和替換的方式設(shè)計了具有抗菌潛力的雜合肽CC31[12]，通過巴斯德畢赤酵母工程菌進(jìn)行表達(dá)，得到含抗菌肽CC31 巴斯德畢赤酵母重組工程菌。

1.2 培養(yǎng)基

優(yōu)化后 BSM 培養(yǎng)基：85% H3PO426.7 ml·L-1、CaSO4·2H2O 0.94 g·L-1、K2SO418.2 g·L-1、KOH 4.13 g·L-1、MgSO4·2H2O 14.9 g·L-1、甘油 30 g·L-1、葡萄糖 30 g·L-1、（NH4）2SO415 g·L-1、酵母浸出物 10 g·L-1。

1.3 固態(tài)發(fā)酵飼料的制備

1.3.1 畢赤酵母種子菌液制備

將含抗菌肽CC31 酵母重組工程菌劃線YPD 固體平板（含 Zeocin 50 μg·mL-1），30 ℃恒溫培養(yǎng)。選取單一的菌落接種到50 mL 優(yōu)化BSM 液體培養(yǎng)基，30 ℃，200 rpm 震蕩培養(yǎng)54 h。將上述種子液按照10%的量轉(zhuǎn)接于新的含有500 mL 優(yōu)化BSM 液體培養(yǎng)基的 2 L 搖瓶中，30 ℃，200 rpm·min-1震蕩培養(yǎng)42 h 作為種子液。

1.3.2 篩選最佳發(fā)酵底物粒度

取180 g 豆粕與20 g 麥麩，粒度水平分別為40～60 目、60～80 目、80 目以上，加入等量滅菌蒸餾水，再加入等量發(fā)酵菌液，充分混合均勻，維持pH 自然值，將袋中充滿空氣，每個水平重復(fù)3 次，每天（0～8 d）每個水平隨機(jī)抽取3 袋，測定小蛋白菌體濃度，確定最佳發(fā)酵粒度。

1.3.3 篩選最佳接種量和含水量

在最佳發(fā)酵粒度的基礎(chǔ)上，采用均勻試驗設(shè)計（表1、表2）篩選接種量和含水量，利用DPSV7.05 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次逐步回歸分析。

表1 因素水平表Table 1 The factor and level table of uniform design

表2 試驗表Table 2 The test table of uniform design

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 小分子蛋白含量的測定

利用真空冷凍干燥機(jī)（Delta1-24LSC，德國Christ）凍干發(fā)酵豆粕，置于組織粉碎機(jī)（LMLW-320/2 型，荷蘭Laarmann）充分粉碎。稱取2 g 樣品振蕩混合于40 mL PBS，靜置過夜，3 000 r·min-1離心 30 min，取離心后的上清液轉(zhuǎn)移100 000 濾管，再次進(jìn)行5 000 r·min-1離心2 h，棄上清液，剩余部分轉(zhuǎn)移30 000 濾管后再次進(jìn)行 5 000 r·min-1離心 2 h，棄上清液，然后使用碧云天BCA 蛋白濃度測定試劑盒對其蛋白含量進(jìn)行測定，具體步驟參照試劑盒使用說明。

1.4.2 回歸方程建立

以接種量（X1）、含水量（X2）為自變量，并通過固態(tài)發(fā)酵試驗測定所得發(fā)酵產(chǎn)物中的小分子蛋白濃度（Y）為因變量，建立回歸方程。

1.4.3 Tricine-SDS-PAGE 檢測

將65%硫酸銨溶液等體積加入上述超濾后的菌液中低溫攪拌使蛋白充分沉淀，低溫4 ℃下進(jìn)行4 000 r·min-1離心10 min，取沉淀后進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE 檢測。

1.4.4 粗蛋白、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量測定

粗蛋白（CP） 含量測定使用凱氏定氮法（GB5511-85），參照Van Soest 分析體系中提供的方法采用纖維分析儀（ANKOM 200/220，美國）測定中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）的含量[13]。

2 結(jié)果分析

2.1 發(fā)酵粒度的篩選

隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵后的豆粕中小分子蛋白濃度逐漸提高（圖1），后期趨于平穩(wěn)。選用的40～60 目發(fā)酵底物在前5 d 時蛋白濃度迅速提高，其增加速度高于其他目數(shù)底物；60～80 目發(fā)酵底物蛋白濃度提高較為緩慢，后期趨于平穩(wěn)；80 目以上發(fā)酵底物在前5 d 蛋白濃度提高較快，但后期處于下降狀態(tài)，逐漸低于40～60 目發(fā)酵底物蛋白濃度。通過發(fā)酵時間和蛋白濃度含量進(jìn)行綜合分析都得出40～60 目可以最為最佳發(fā)酵粒度。

圖1 粒度對蛋白濃度的影響Fig 1 Effect of particle size on protein concentration

2.2 含水量和接種量條件的篩選與回歸模型的建立

通過對接種量和含水量的篩選優(yōu)化，測得蛋白濃度如表3 所示。

接種量（X1）和含水量（X2）為自變量，測得發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白濃度（Y），擬合回歸曲線。采用DPSV7.05 軟件均勻設(shè)計模塊對結(jié)果進(jìn)行多元二次回歸分析，得到回歸模型為：

R2=0.99，F(xiàn) 值為 31.69，P 值為 0.13，得出回歸方程線性關(guān)系良好。利用所得公式預(yù)測接種量為9.85%，含水量為51.22%，小分子蛋白濃度可以達(dá)到最高為 148.99 mg·L-1。

表3 均勻試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 3 The scheme and the results of uniform design

2.3 擬合曲線的驗證和小分子蛋白Tricine-SDSPAGE

依據(jù)擬合曲線最優(yōu)含水量和接種量為參考，選用10%的接種量，50%的含水量時，分別重復(fù)3 次試驗，檢測后得到小分子蛋白濃度可達(dá)156.23 mg·L-1，與預(yù)測值相比較發(fā)現(xiàn)誤差僅為4.63%，說明建立的擬合曲線預(yù)測發(fā)酵結(jié)果。對濃縮后的小分子蛋白進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE 驗證，圖2 顯示蛋白條帶與目的蛋白條帶相吻合，發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)物包含所需要的抗菌肽CC31，且含量相對較高，通過固態(tài)發(fā)酵可以為抗菌肽的開發(fā)運(yùn)用提供新的有效途徑。

圖2 CC31 分子分離效果的Tricine-SDS-PAGEFig.2 The analysis of Tricine-SDS-PAGE for CC31

2.4 發(fā)酵后 CP、NDF 和 ADF 變化

通過與原料相比較，發(fā)酵后CP 含量得到明顯的提高，NDF 和ADF 含量的變化幅度較小，說明含抗菌肽CC31 畢赤酵母工程菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵主要改變蛋白含量，對NDF 和ADF 含量影響較低。

表4 畢赤酵母菌對發(fā)酵豆粕營養(yǎng)的影響（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 4 Effect of pichia pastoris on the nutrition of fermented soybean meal（dry matter basis）

2.5 畢赤酵母固態(tài)發(fā)酵的豆粕形態(tài)

通過擬合曲線進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)酵后形態(tài)如圖3。與原料相比，發(fā)酵后的豆粕色澤暗黃，顆粒感更加明顯，顆粒度遠(yuǎn)大于原料豆粕，手感較為滑膩，質(zhì)地較軟，有一定的彈性，氣味為一股微酸豆味，同時含有酵母菌味。

圖3 發(fā)酵豆粕形態(tài)（左側(cè)為畢赤酵母發(fā)酵料 右側(cè)為原料）Fig.3 The morphology of fermented soybean meal

3 討論

3.1 發(fā)酵粒度對發(fā)酵品質(zhì)的影響

目前固態(tài)發(fā)酵的影響因素探究主要集中在溫度、水分等條件，對發(fā)酵底物顆粒的大小研究的相對較少。Farinas[14]在固態(tài)發(fā)酵使用中指出底物或載體的選用應(yīng)著重考慮原料的成本以及可用性，同時其他特性如顆粒大小等也應(yīng)作為重點的選擇。原料顆粒的大小關(guān)系到發(fā)酵菌種與發(fā)酵空間中氧氣的結(jié)合程度，較小底物顆粒的累積容易造成發(fā)酵原料內(nèi)氧含量的降低，需要靠通風(fēng)或攪拌提高基質(zhì)內(nèi)氧氣的含量，但攪拌和翻動次數(shù)的增加，極易損傷菌絲，加速基質(zhì)內(nèi)水分的流失，導(dǎo)致菌體生長受限甚至死亡；底物顆粒較大使基質(zhì)內(nèi)留有足夠的間隙，原料與空氣的接觸度相對增加，但容易造成發(fā)酵不完全，發(fā)酵后顆粒硬度大[15]。管軍軍等[16]研究得出發(fā)酵底物粒度的增加可以增加基質(zhì)內(nèi)間隙，但發(fā)酵后底物硬度相對增加；而細(xì)小粒度底物發(fā)酵后顆粒硬度降低，由于原料間隙相對較小互相堆積，造成發(fā)酵后底物整體體積收縮。合適的發(fā)酵粒度有助于得到更好的發(fā)酵產(chǎn)物。試驗表明，40～60 目的豆粕底物發(fā)酵品質(zhì)優(yōu)于其他目數(shù)，說明40～60 目發(fā)酵料能滿足酵母菌在發(fā)酵過程中的需氧量，較好的完成發(fā)酵的過程。

3.2 接種量和含水量對發(fā)酵品質(zhì)的影響

接種量與含水量的配比可以直接決定發(fā)酵底物的品質(zhì)。合適的接種量可以加速基質(zhì)內(nèi)菌種的生長與繁殖，加快發(fā)酵的進(jìn)行，防止雜菌的污染，提高底物中蛋白質(zhì)的含量。底物含水量是進(jìn)行發(fā)酵的決定性因素，直接影響微生物的生長速度及其代謝能力。較高的含水量將造成底物氣體流通性降低，底物顆粒產(chǎn)生板結(jié)，同時易滋生雜菌影響發(fā)酵品質(zhì)；較低的含水量，底物吸水程度受限，膨脹度下降，營養(yǎng)物質(zhì)供給受到限制，菌體生長與繁殖受到抑制[17]。因此，選擇恰當(dāng)?shù)慕臃N量與含水量在一定程度上可以改善發(fā)酵的品質(zhì)和發(fā)酵的效率。試驗得出，選用畢赤酵母工程菌作為發(fā)酵菌株，在底物50%的含水量，10%的接種量情況下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物中小分子蛋白含量可以達(dá)到 156 mg·L-1。Chi 等[18]研究得出，選用合適的發(fā)酵菌種和發(fā)酵條件在一定程度上可以提高發(fā)酵后豆粕中生物活性物質(zhì)。吳正可等[19]通過正交試驗優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵的溫度、含水量以及接種量后發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌和釀酒酵母和枯草芽孢桿菌（比例1∶3∶2）的復(fù)合菌進(jìn)行菜籽粕固態(tài)發(fā)酵，可以有效降解菜籽粕硫甙含量，提高多肽和總酸含量，改善其營養(yǎng)價值。張佳斌等[20]研究得出發(fā)酵底物的所處溫度、菌種的接種量以及底物含水量可以直接決定枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕的品質(zhì)。在合適的菌種條件下，優(yōu)化發(fā)酵的溫度、含水量以及接種量可以直接提高發(fā)酵底物營養(yǎng)成分的含量，降低抗?fàn)I養(yǎng)因子的水平，改善飼料的品質(zhì)，提高其適口性。

3.3 發(fā)酵前后原料品質(zhì)的變化

豆粕因較高的蛋白質(zhì)和多糖等營養(yǎng)成分，被畜牧行業(yè)廣泛的用作各種動物的蛋白飼料原料，但較高含量的抗?fàn)I養(yǎng)因子也限制了豆粕營養(yǎng)的利用程度。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)利用微生物的分解和轉(zhuǎn)化能力可以消除豆粕中大部分的抗?fàn)I養(yǎng)因子，生成被動物直接吸收利用的可溶性多肽、未知的促生長因子等一系列物質(zhì)[21]。吝常華等[22]利用單菌（解淀粉芽孢桿菌）和混菌（解淀粉芽孢桿菌∶植物乳桿菌∶釀酒酵母=9∶3∶2）固態(tài)發(fā)酵豆粕，發(fā)現(xiàn)明顯提高小肽、粗蛋白、粗灰分、粗脂肪含量，在一定程度上可以改善豆粕的品質(zhì)。羅遠(yuǎn)琴等[23]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌、釀酒酵母及其復(fù)合菌發(fā)酵棉粕發(fā)現(xiàn)酸溶蛋白、棉籽肽以及總游離氨基酸含量得到提高，顯著改善棉粕的營養(yǎng)價值，復(fù)合菌發(fā)酵后有濃郁的酒香味，在一定程度上更能提高其適口性。于新穎等[24]研究發(fā)現(xiàn)粗壯脈紋孢菌進(jìn)行菜籽粕固態(tài)發(fā)酵粗蛋白、可溶性蛋白、氨基酸和類胡蘿卜素含量均呈現(xiàn)上升趨勢，粗纖維、單寧、植酸以及硫甙含量呈現(xiàn)下降趨勢，有效解決了菜籽粕未經(jīng)處理用于飼料原料的安全問題。Taliercio 等[25]和Kim[26]的研究指出發(fā)酵后的豆粕在一定限度上可以有效降低致敏性，降低對動物的危害。試驗結(jié)果表明，通過固態(tài)發(fā)酵可以提高豆粕原料的蛋白質(zhì)含量，發(fā)酵后質(zhì)地更加柔軟，且伴隨一定的彈性，氣味為一股微酸豆味，更容易被畜禽所采食，是一種不可多得的生物飼料。

4 結(jié)論

（1）含抗菌肽CC31 畢赤酵母工程菌最佳固態(tài)發(fā)酵的底物顆粒度為40～60 目。

（2）小分子蛋白濃度擬合曲線：Y=113.874 5+0.915 5 X1+1.195 2 X2-0.046 5 X1·X1-0.116 7 X·2X2，R2=0.99，通過曲線預(yù)測X1值為9.85%，X2值為51.22%時，小分子蛋白濃度達(dá)到最大值（Y）為148.99 mg·L-1。

（3）含抗菌肽CC31 畢赤酵母工程菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵能有效的提高小分子功能性蛋白含量，進(jìn)而提高飼料原料粗蛋白含量。