劉 寧，崔梅英，王明月，楊澤斌，王 浩，毛 禹，方楷漪，夏 薇，關(guān)新剛

(北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

類彈性蛋白樣多肽(elastin-like polypeptide，ELP)是一種由基因工程設(shè)計(jì)合成的非免疫原性且無熱原性的具有良好生物相容性的蛋白質(zhì)聚合物[1-2]，ELP主要是由五肽重復(fù)序列單元構(gòu)成，即Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)，其中Xaa是除脯氨酸以外的任一種氨基酸[3-5].ELP具有可逆相變循環(huán)(Inverse transitioncycling，ITC)的特性，即溫度低于其相變溫度，ELP多肽以高度可溶的形式存在于水溶液中；若溫度高于其相變溫度，ELP開始聚集，形成不溶物聚集體，且該過程可逆[6].由于ELP具有的這種特殊性質(zhì)，在大腸桿菌中高產(chǎn)量表達(dá)的ELP蛋白可以利用可逆相變的特性進(jìn)行快速純化[7].紅色熒光蛋白(mCherry)是SHANER等[8]將發(fā)色基團(tuán)mRFP進(jìn)行位點(diǎn)突變得到的一種單體紅色熒光蛋白[9]，mCherry的熒光強(qiáng)度高且穩(wěn)定性好[10].KALIMUTHU等[11]將含有mCherry基因的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人間充質(zhì)干細(xì)胞，表達(dá)紅色熒光mCherry基因，用生物發(fā)光成像法追蹤間充質(zhì)干細(xì)胞在荷瘤小鼠中的遷移.

在本研究中，基于ELP蛋白的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)及mCherry的熒光成像特性，我們構(gòu)建了ELP-mCherry原核表達(dá)載體，表達(dá)純化了ELP-mCherry融合蛋白，探討了其與人腎上皮細(xì)胞HEK293T和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞的相容性，為設(shè)計(jì)開發(fā)新型的熒光示蹤組織工程材料奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要儀器和試劑

pET28a-ELP和pEGFP-N1-mCherry質(zhì)粒(Origene公司，美國)；限制性內(nèi)切酶XbaI與XhoI(生工生物工程(上海)有限公司)；大腸桿菌BL21菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株；HEK293T細(xì)胞、NIH3T3細(xì)胞復(fù)蘇自本實(shí)驗(yàn)室凍存細(xì)胞；胰蛋白胨、酵母提取物、卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(生工生物工程(上海)有限公司)；多功能酶標(biāo)儀Tecan Spark(上海帝肯公司)；PCR儀、核酸電泳以及SDS-PAGE電泳所使用的電泳儀與電泳槽(Bio-Rad公司，美國).

1.2 ELP-mCherry原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)GenBank中mCherry基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)包含mCherry基因編碼框的引物(生工生物工程(上海)有限公司)，并在引物兩端分別添加XbaI和XhoI酶切位點(diǎn).以pEGFP-N1-mCherry為模板通過PCR擴(kuò)增獲得mCherry片段，凝膠回收mCherry片段.mCherry片段和pET28a-ELP質(zhì)粒分別用1 μL 限制性內(nèi)切酶XbaI和XhoI酶切，回收目的片段，利用T4 DNA連接酶在4 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，接種于含有卡那霉素的LB平板上過夜培養(yǎng).從平板培養(yǎng)基中挑取單個(gè)菌落，170 r/min搖床過夜，提取質(zhì)粒后用XbaI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行單酶切驗(yàn)證，再用XbaI和XhoI進(jìn)行雙酶切及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(Bio-rad)，并將構(gòu)建的重組質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析.

1.3 ELP-mCherry融合蛋白的原核表達(dá)

將構(gòu)建的pET28a-ELP-mCherry質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(BL21)中，過夜培養(yǎng)后挑取單克隆菌落，接種于20 mL含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、170 r/min搖菌過夜；第2天按1∶50接種于1 L含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，當(dāng)OD600達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG(終濃度1 mmol/L)，37 ℃條件下培養(yǎng)6 h誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；離心收集菌體，PBS重懸菌體沉淀后加入苯甲基磺酰氟(PMSF，終濃度1 mol/L)，應(yīng)用超聲破碎菌體，離心收集上清和沉淀，通過SDS-PAGE電泳分析蛋白的表達(dá)情況.

1.4 ELP-mCherry融合蛋白的純化

利用ITC法快速純化ELP-mCherry融合蛋白，將裂解液上清用NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，4 ℃振蕩過夜；第2天將裂解液上清在4 ℃下，5 000 r/min離心90 min，去除不溶性蛋白沉淀；將分離的上清恢復(fù)至室溫后，置于37 ℃搖床，250 r/min震蕩3 h，在3 h內(nèi)分3次加入NaCl至終濃度為1 mol/L，37 ℃離心收集沉淀，PBS重懸沉淀.以上過程重復(fù)兩個(gè)循環(huán)，通過SDS-PAGE電泳分析蛋白的純化情況.

1.5 ELP-mCherry融合蛋白的細(xì)胞相容性

用MTT法檢測(cè)ELP-mCherry融合蛋白對(duì)HEK293T細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞增殖能力的影響.將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293T細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞以5 000個(gè)/孔接種于96孔板中，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；第2天每孔中加入終濃度25、50、100、200、300 μg/mL的ELP-mCherry融合蛋白，每個(gè)ELP-mCherry融合蛋白濃度做5個(gè)平行孔.培養(yǎng)48 h后每孔加入20 μL的MTT，37 ℃孵育4 h后，每孔再加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，沉淀充分溶解后在酶標(biāo)儀(TECAN M200)上測(cè)定 OD490時(shí)每孔的吸光度值.

2 結(jié) 果

2.1 ELP-mCherry原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將從mCherry質(zhì)粒中獲得的PCR產(chǎn)物與pET28a- ELP質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶XbaI和XhoI雙酶切后，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠分離，將目的片段凝膠回收后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Kana平板，獲得陽性克隆.提取質(zhì)粒通過酶切進(jìn)行驗(yàn)證，雙酶切產(chǎn)生的片段與預(yù)期大小一致，提示pET28a-ELP-mCherry重組質(zhì)粒初步構(gòu)建成功.見圖1.DNA測(cè)序結(jié)果顯示mCherry基因被成功插入表達(dá)載體中，沒有發(fā)生堿基突變和移位，表明pET28a-ELP-mCherry重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.見圖2.

M.DL 5000 DNA marker；1.Xba I單酶切結(jié)果；2.Xba I和Xho I雙酶切結(jié)果.圖1pET28a-ELP-mCherry重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1Identification of pET28a-ELP-mCherry recombinant plasmid by enzyme digestion

圖2pET28a-ELP-mCherry重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果Fig.2Sequencing result of pET28a-ELP- mCherry recombinant plasmid

2.2 ELP-mCherry融合蛋白的原核表達(dá)

將pET28a-ELP-mCherry表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(BL21)中，誘導(dǎo)ELP-mCherry重組蛋白表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示：在細(xì)胞裂解液的上清在分子量30 kDa左右出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，與ELP-mCherry融合蛋白的預(yù)計(jì)分子量相符，說明ELP-mCherry融合蛋白存在于細(xì)胞裂解液上清中，然后再利用ITC法進(jìn)行快速純化.見圖3.

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.菌體細(xì)胞裂解液上清；2.菌體細(xì)胞裂解液沉淀.圖3ELP-mCherry重組蛋白的原核表達(dá)Fig.3Prokaryotic expression of ELP-mCherry recombinant protein

2.3 ELP-mCherry融合蛋白的純化

利用ITC法純化ELP-mCherry融合蛋白，裂解液上清通過兩輪ITC循環(huán)的結(jié)果顯示：電泳條帶純化后的ELP-mCherry融合蛋白在30 kDa位置顯示單一條帶，未出現(xiàn)明顯的蛋白雜帶，且蛋白分子量與ELP-mCherry融合蛋白相符.因此，可以確定純化蛋白為ELP-mCherry蛋白.見圖4.

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化后的ELP-mCherry融合蛋白.圖4ELP-mCherry融合蛋白純化Fig.4Purification of ELP-mCherry fusion protein

2.4 ELP-mCherry融合蛋白細(xì)胞相容性分析

將不同濃度ELP-mCherry融合蛋白(25、50、100、200、300 μg/mL)分別處理HEK293T細(xì)胞及NIH3T3細(xì)胞48 h后，通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率.處理48 h后，HEK293T細(xì)胞的存活率在各個(gè)濃度下都超過100%，NIH3T3細(xì)胞在測(cè)試所有濃度下也接近100%，這些結(jié)果說明ELP-mCherry融合蛋白在兩種細(xì)胞中都具有良好的細(xì)胞相容性.見圖5.

圖5ELP-mCherry融合蛋白的細(xì)胞相容性Fig.5Cell compatibility of ELP-mCherry fusion protein

3 結(jié) 論

利用傳統(tǒng)親和層析法(麥芽糖結(jié)合蛋白MBP、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶GST、多聚組氨酸標(biāo)簽His、多聚精氨酸Arg)可以快速獲得高純度的目的蛋白，然而純化介質(zhì)成本較高，因此，迫切需要開發(fā)一種成本低廉的高純度蛋白量產(chǎn)方法[12-13].1999年，MEYER等[14]首次將ELP與其他蛋白融合表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)了其可逆溫度相變轉(zhuǎn)換的特性，從此開創(chuàng)了一種新的蛋白純化方法，稱為“ELP化”，即將目的蛋白基因與ELP基因的N末端或C末端融合而獲得融合蛋白的方法.由于類彈性蛋白多肽類衍生蛋白具有可逆溫度相變(低溫溶解，高溫聚集)特性，應(yīng)用ITC法對(duì)ELPs蛋白進(jìn)行純化只需要加鹽、升溫(蛋白聚集)、離心(收集蛋白沉淀)、蛋白復(fù)溶幾個(gè)步驟即可完成，多數(shù)情況下只需要2～3輪ITC純化即可獲得高純度的目的蛋白，無需昂貴的親和層析介質(zhì)，極大地降低了蛋白的生產(chǎn)成本，有利于進(jìn)行大規(guī)模的蛋白質(zhì)生產(chǎn).近年來 “ELP化”法在重組蛋白純化、改善目的蛋白半衰期、提升蛋白產(chǎn)量、作為蛋白的遞送載體等方面獲得了廣泛應(yīng)用[15-18].例如，MOKTAN等[19]將細(xì)胞穿膜肽和促凋亡肽分別融合在ELP基因的N末端和C末端，通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備了一種新型的蛋白抗腫瘤藥物SynB1-ELP-KLAK，結(jié)果顯示融合蛋白具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力.PHAN等[20]將兩種禽流感H5N1抗原與ELP融合后在轉(zhuǎn)基因煙草中進(jìn)行融合蛋白表達(dá)，并利用ITC方法成功獲得了融合蛋白，結(jié)果顯示ELP化方法在煙草表達(dá)系統(tǒng)中能夠顯著提高目的蛋白產(chǎn)量.FLOSS等[21]將anti-HIV-1單克隆抗體2F5與 ELP 融合后在中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)也獲得了成功表達(dá)，結(jié)果顯示單克隆抗體與ELP融合并未影響2F5與抗原的結(jié)合活性，顯示ELP化法在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中的有效性.

本研究結(jié)果顯示：通過構(gòu)建ELP-mCherry融合蛋白的表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行融合蛋白表達(dá)，應(yīng)用ITC法對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，得到純度較高的ELP-mCherry融合蛋白.鑒于ELP蛋白在細(xì)胞中極佳的細(xì)胞相容性，我們隨后檢測(cè)了ELP-mCherry融合蛋白在HEK293T細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞中的細(xì)胞相容性，結(jié)果顯示融合蛋白在兩種細(xì)胞的存活率超過或接近100%，提示引入mCherry并未降低ELP的細(xì)胞相容性，為接下來的組織工程應(yīng)用奠定了良好的材料基礎(chǔ).mCherry紅色熒光蛋白的最大激發(fā)波長(zhǎng)為587 nm[22-24]，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、表達(dá)量高、測(cè)定簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，因此，被廣泛用來對(duì)組織細(xì)胞定位進(jìn)行示蹤.將ELP與mCherry制備成ELP-mCherry融合蛋白，既可以利用ELP的可逆溫度相變轉(zhuǎn)換特性純化的融合蛋白，又可以利用mCherry高度穩(wěn)定的紅色熒光追蹤其分布[25]，因此，可作為理想的集示蹤與支架功能于一身的生物材料用于皮膚損傷愈合、組織修復(fù)等工程應(yīng)用.

綜上所述，本研究成功構(gòu)建pET28a-ELP-mCherry表達(dá)載體，表達(dá)并純化ELP-mCherry融合蛋白，ELP-mCherry融合蛋白對(duì)HEK293T細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞具有良好的細(xì)胞相容性，此研究為開發(fā)新型的組織工程示蹤材料奠定了基礎(chǔ).