李大鵬, 謝光珊, 謝佩斯, 朱 林, 蔡宗葦

(香港浸會(huì)大學(xué), 環(huán)境與生物分析國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 香港 999077)

蛋白質(zhì)糖基化是生物體內(nèi)最豐富且最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾(PTM)之一,其在蛋白質(zhì)折疊、穩(wěn)定、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫應(yīng)答等生物功能中有著重要作用[1,2]。研究表明,異常的蛋白糖基化與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3],例如癌癥[4]、老年癡呆癥[5]和免疫缺陷[6]。因此,糖蛋白組學(xué)分析對(duì)于深入了解疾病的機(jī)理,以及發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物和藥物靶標(biāo)至關(guān)重要[7,8]。質(zhì)譜(MS)一直是糖蛋白組學(xué)分析強(qiáng)有力的工具[9,10]。然而,糖肽由于豐度低、離子化效率低,且容易受非糖肽信號(hào)的干擾,使得基于質(zhì)譜的糖蛋白組學(xué)分析仍然具有巨大挑戰(zhàn)[11]。因此,在質(zhì)譜分析前對(duì)糖肽進(jìn)行高效富集,是糖蛋白分析至關(guān)重要的一步。

目前,糖肽富集的方法主要包括凝集素親和法[12]、肼化學(xué)法[13]、硼酸親和色譜法[14]和親水相互作用色譜法(HILIC)[15]。其中,基于HILIC的富集方法因其無偏向性、優(yōu)異的相容性、良好的選擇性和可重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)得到了廣泛發(fā)展[16]。金屬有機(jī)框架(MOF)納米材料,由于具有較大的比表面積和均勻且可調(diào)控的孔隙[17],目前廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析,例如MIL-101(NH2)@Au-Cys[18]、UiO-66-COOH[19]、Fe3O4@PDA@Zr-SO3H[20]等,展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。因此,開發(fā)基于HILIC的親水性好、富集能力高、制備方法簡(jiǎn)便的新型MOF納米復(fù)合材料十分必要。

本研究利用兩步合成法,制備了一種新型的兩性離子雙功能化納米金(AuGC)修飾的超親水性沸石咪唑骨架(ZIF-8)納米復(fù)合材料(AuGC/ZIF-8)，同時(shí)聯(lián)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS),用于糖肽的高效富集和分析。谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)雙重功能化不僅可以控制和穩(wěn)定金納米簇,而且還提供了豐富的游離羧酸和氨基。利用GSH和Cys二者的超親水性以及低位阻協(xié)同作用,實(shí)現(xiàn)高效的糖肽選擇性富集。利用上述優(yōu)勢(shì),AuGC/ZIF-8復(fù)合納米材料顯示出優(yōu)異的親水性,良好的生物相容性和穩(wěn)定性,且對(duì)糖肽具有高選擇性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

粉末X射線衍射儀(XRD)、Rapiflex MALDI-TOF MS儀(Bruker Daltonics公司,德國(guó)); X射線光電子能譜儀(XPS, Thermo Electron公司,美國(guó));傅立葉變換紅外光譜儀(FT-IR, Perkin Elmer公司,美國(guó))。

六水合硝酸鋅(Zn(NO3)2·6H2O)、2-甲基咪唑(2-MIM)、氯金酸(HAuCl4)、Cys、GSH、2,5-二羥基苯甲酸(DHB)、碳酸氫銨(NH4HCO3)、甲酸(FA)、辣根過氧化物酶(HRP)、牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

實(shí)驗(yàn)過程中使用的水均由Milli-Q超純水系統(tǒng)純化去離子水(Millipore公司,美國(guó))。HPLC級(jí)乙腈(ACN)和甲醇(MeOH)購(gòu)自美國(guó)VWR Chemicals BDH公司。

1.2 AuGC/ZIF-8納米復(fù)合材料的合成

在室溫下將HAuCl4(20 mmol/L, 0.50 mL)、GSH(100 mmol/L, 0.15 mL)和Cys(50 mmol/L, 0.15 mL)水溶液加入至4.20 mL去離子水中混合均勻,然后加熱至70 ℃,溫和攪拌24 h,得到淡黃色溶液,即AuGC,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將Zn(NO3)2·6H2O水溶液(0.50 mol/L, 2 mL)加入至2-MIM溶液(3.45 mol/L, 20 mL)中混合均勻,室溫下勻速攪拌0.5 h,以16 000 g離心10 min后,收集得到白色固體,用去離子水洗滌3次,于60 ℃真空干燥,得到白色粉末,即ZIF-8[21]。

將ZIF-8粉末(20 mg)均勻分散在AuGC溶液(5 mL)中,并勻速攪拌3 h,得到淡黃色固體,用去離子水洗滌,真空干燥,即可得到AuGC/ZIF-8納米復(fù)合材料。

1.3 樣品前處理

將1 mg HRP溶于0.5 mL 25 mmol/L NH4HCO3中,于95 ℃加熱10 min,使蛋白質(zhì)變性,冷卻至室溫后,加入胰蛋白酶(1∶40,質(zhì)量比),于37 ℃孵育16 h,然后室溫下加入2 μL甲酸終止反應(yīng)。冷凍干燥后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 糖肽富集

將100 μg AuGC/ZIF-8均勻分散在100 μL含有HRP酶解物(30 ng/μL)的上樣緩沖液ACN-H2O-TFA(95∶4.9∶0.1, v/v/v)中,混合均勻后于37 ℃振蕩孵育0.5 h。然后,用洗滌緩沖液ACN-H2O-FA(85∶15∶0.5, v/v/v)洗滌3次。最后,用15 μL洗脫緩沖液ACN-H2O-FA(30∶70∶0.5, v/v/v)振蕩孵育10 min洗脫富集的糖肽。取1 μL洗脫的糖肽與1 μL 30 mg/mL DHB溶液(溶于ACN-H2O-TFA(70∶29∶1, v/v/v))混合均勻,進(jìn)行MALDI-TOF MS分析。

1.5 MALDI-TOF MS條件

離子源:電噴霧電離(ESI)源;離子源溫度:110 ℃;離子模式:正離子反射器模式;加速電壓:20 kV;碰撞解離能量:40 eV;氮?dú)饧す?337 nm;去溶劑氣體及流速:氮?dú)?8 L/min;檢測(cè)范圍:m/z1 000～5 500。采用Flex Analysis(4.0)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析;選擇信噪比(S/N)>3的質(zhì)譜峰統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 AuGC/ZIF-8納米復(fù)合材料的合成與表征

圖1a為AuGC/ZIF-8納米復(fù)合材料的合成示意圖。通過GSH(或Cys)配體中的羧基與Zn2+之間的配位相互作用實(shí)現(xiàn)AuGC固定化修飾在ZIF-8表面。ZIF-8在溫和條件下容易合成,其均一的多孔結(jié)構(gòu)和較大的比表面積,是理想的納米基質(zhì)材料。由于GSH配體的電荷和空間穩(wěn)定作用,核殼結(jié)構(gòu)的AuGC納米簇具有良好的穩(wěn)定性和水溶性。GSH在合成過程中兼具還原和保護(hù)劑作用[22]。Cys進(jìn)一步減少AuGC納米簇表面的空間位阻(見圖1b),為糖肽富集提供更多的捕獲位點(diǎn),從而實(shí)現(xiàn)高效的糖肽富集。

圖 1 (a)AuGC/ZIF-8納米復(fù)合材料的合成過程和(b)Cys、GSH雙功能化金納米簇Fig. 1 (a) Synthesis procedure of zwitterionic dual-functional metal-organic framework nanocomposite (AuGC/ZIF-8) and (b) cysteine (Cys), glutathione (GSH) dual functionalized the surface of gold nanocluster

通過X射線衍射對(duì)AuGC/ZIF-8的晶體進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果觀察到在2θ為011°、002°、112°、222°、134°處有典型的ZIF-8型衍射峰,表明AuGC/ZIF-8晶體結(jié)構(gòu)完好[23,24]。利用X射線光電子能譜對(duì)AuGC/ZIF-8進(jìn)一步表征,檢測(cè)到Zn 2p、O 1s、C 1s、S 2p、Au 4f對(duì)應(yīng)的峰譜。Au 4f的高分辨率XPS光譜結(jié)果顯示,Au-S鍵的結(jié)合能峰值在83.9 eV(Au 4f7/2)和87.5 eV(Au 4f5/2)附近,與報(bào)道高度一致[21]。FT-IR指紋圖譜中,在1 500～1 660和1 260 (COO-)、1 403 (C-N)、2 550～2 750 (-SH)、2 900～3 420(-NH2) cm-1處分別出現(xiàn)了吸收峰[25-27],表明AuGC成功修飾在ZIF-8的表面上。此外,AuGC/ZIF-8比表面積為701.57 m/g,水接觸角為20.82°,表明合成的納米材料比表面積較大且具有超親水性。

2.2 AuGC/ZIF-8用于糖肽富集分析

實(shí)驗(yàn)采用MALDI-TOF MS,考察了AuGC/ZIF-8對(duì)標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白HRP糖肽的富集性能。首先比較了富集前和AuGC/ZIF-8富集后的糖基化肽的質(zhì)譜圖(見圖2)。通過分析,由于信號(hào)干擾和非糖肽的抑制,富集前僅檢測(cè)到一個(gè)HRP糖肽的信號(hào)(見圖2a)。相比之下,富集之后顯著降低了非糖肽引起的背景噪聲,檢測(cè)到19個(gè)糖肽峰(見圖2b)。結(jié)果表明,AuGC/ZIF-8對(duì)糖肽具有顯著的富集作用。富集到的糖基化肽段的詳細(xì)序列信息見表1。

表 1 經(jīng)AuGC/ZIF-8富集后HRP酶解物中糖肽的詳細(xì)信息

圖 2 HRP酶解液(3 μg)用AuGC/ZIF-8富集(a)前、(b)后的MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖Fig. 2 MALDI-TOF MS spectra of horseradish peroxidase(HRP) tryptic digest (3 μg) (a) direct analysis and (b) after enrichment by AuGC/ZIF-8

通過分析不同AuGC/ZIF-8用量下(10、20、40、60、80、100 μg),富集到HRP特征糖肽質(zhì)譜豐度的大小,考察AuGC/ZIF-8的富集能力。結(jié)果表明,AuGC/ZIF-8對(duì)糖肽的富集能力高達(dá)250 μg/mg。

考慮到復(fù)雜樣品中糖蛋白的豐度較低,本研究進(jìn)一步考察了基于AuGC/ZIF-8富集的MALDI-TOF MS分析方法的靈敏度。如圖3a所示,分別測(cè)定了不同HRP含量下(50、3、0.3 ng/μL)該方法對(duì)糖肽的檢測(cè)能力。結(jié)果表明,當(dāng)HRP含量低至0.3 ng/μL時(shí),仍然可以觀察到2個(gè)較強(qiáng)的糖肽信號(hào)(S/N> 3),表明本實(shí)驗(yàn)方法具有較高的靈敏度,對(duì)于選擇性富集復(fù)雜樣品中的低豐度糖肽具有重要意義。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該方法對(duì)糖肽的選擇性,配制了不同質(zhì)量比的HRP和BSA的混合物(1∶10、1∶100、1∶200)進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果如圖3b所示,即使比例低至1∶200,經(jīng)過AuGC/ZIF-8富集后,仍然可以檢測(cè)到2個(gè)高信號(hào)強(qiáng)度的糖肽,幾乎不受非糖肽的干擾,說明本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)糖肽具有較強(qiáng)的選擇性富集能力。

圖 3 (a)不同含量HRP酶解液和(b)不同質(zhì)量比的HRP和BSA酶解液通過AuGC/ZIF-8富集后的MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖Fig. 3 MALDI-TOF MS spectra of (a) various contents of HRP digest and (b) the mixture of HRP and bovine serum albumin (BSA) tryptic digest with various mass ratios after enrichment by AuGC/ZIF-8

3 結(jié)論

本研究通過一種簡(jiǎn)便且低成本的方法合成了新型的雙功能HILIC納米復(fù)合材料(AuGC/ZIF-8),同時(shí)與MALDI-TOF MS聯(lián)用,成功用于糖基化肽的選擇性富集分析。AuGC/ZIF-8具有較大的富集能力,較高的檢測(cè)靈敏度以及出色的糖肽選擇性,在復(fù)雜生物樣品的糖蛋白組學(xué)研究中將具有巨大的潛力。