謝瑜杰, 陳 輝*, 蓋麗娟, 霍思宇, 范春林, 呂美玲

(1. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院, 北京 100176; 2. 北京合眾恒星檢測科技有限公司, 北京 100176; 3. 安捷倫科技(中國)有限公司, 北京 100102)

農(nóng)藥殘留是食品安全領(lǐng)域長期關(guān)注的問題之一。傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留主流檢測技術(shù)有氣相色譜-質(zhì)譜法[1]、氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法[2-7]和液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法等[8-14]。隨著農(nóng)藥種類的不斷增加,目前世界常用農(nóng)藥已經(jīng)增加到1 100多種[15],傳統(tǒng)農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)已經(jīng)不能滿足實際檢測需求。

高分辨質(zhì)譜以其精確質(zhì)量數(shù)、高分辨率和不依賴標(biāo)準(zhǔn)品進行定性的優(yōu)勢[16,17],在食品中農(nóng)藥殘留高通量篩查方法中得到了廣泛應(yīng)用[18,19]。例如,趙志遠(yuǎn)等[20]應(yīng)用液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(LC-QTOF/MS)建立281種農(nóng)藥的一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫和二級譜圖庫,并采用該數(shù)據(jù)庫和譜圖庫檢索的方式,實現(xiàn)了蘋果、番茄和甘藍(lán)中281種農(nóng)藥殘留的快速篩查。宋偉等[21]應(yīng)用LC-QTOF/MS建立了204種農(nóng)藥的一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫和二級譜圖庫,通過化合物的精確質(zhì)量數(shù)、保留時間、同位素比值等信息對檢測結(jié)果進行自動檢索,從而在無對照標(biāo)準(zhǔn)品的情況下實現(xiàn)了204種農(nóng)藥的定性鑒定。在這些方法中,通常需要2次進樣篩查,即第一次進樣后通過加合離子、保留時間等信息對化合物進行初步篩查,第二次則是針對初篩化合物建立二級采集方法,通過與二級譜圖庫比對進行化合物確證。盡管這種方式進行農(nóng)殘篩查可以獲得較高的靈敏度,但是從快速、高效和節(jié)約成本的角度考慮,建立一次進樣的篩查方法可以顯著提高篩查效率[22]。

全自動MS/MS采集模式(Auto MS/MS)和全離子MS/MS采集模式(All Ions MS/MS)是LC-QTOF/MS中只需要一次進樣便可對化合物進行篩查的兩種采集模式。在Auto MS/MS模式中,輸入加合離子信息和碰撞能后,質(zhì)譜在一個循環(huán)時間內(nèi)交替對一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜進行掃描,根據(jù)一級和二級質(zhì)譜匹配情況對化合物進行確證[23]。在All Ions MS/MS采集模式中,選擇多個碰撞能通道進行采集,通過分析各通道化合物共流出的特征,得到加合離子和碎片離子的共流出關(guān)系,根據(jù)目標(biāo)物的保留時間、加合離子和碎片離子的精確分子量等信息與數(shù)據(jù)庫進行檢索比對,最終對化合物進行確證[24,25]。

紫甘藍(lán)是一種常見的蔬菜,常見于蔬菜沙拉等非加熱類菜品中,在其種植過程中通常會施用多種農(nóng)藥。研究表明,紫甘藍(lán)屬于堿性蔬菜,其紫紅色葉片中色素含量非常豐富,不易凈化。紫甘藍(lán)由于自身基質(zhì)的復(fù)雜性,對其殘留的農(nóng)藥進行準(zhǔn)確篩查的難度相對較大。本文以可篩查農(nóng)藥種數(shù)和假陰性農(nóng)藥種數(shù)作為指標(biāo),考察了Auto MS/MS和All Ions MS/MS兩種不同采集模式,最終選擇All Ions MS/MS采集模式。然后在選擇的采集模式下,建立了基于LC-QTOF/MS的紫甘藍(lán)中415種農(nóng)藥殘留快速篩查方法。將該方法應(yīng)用于2019年能力驗證紫甘藍(lán)中農(nóng)藥殘留的篩查和定量,對該方法的準(zhǔn)確性和可靠性進行了考察和驗證。與傳統(tǒng)兩次采集進行篩查的方法相比,本文建立的一次進樣對紫甘藍(lán)中農(nóng)藥多殘留進行定性篩查和定量測定的方法,提高了農(nóng)藥殘留篩查的效率,可以為水果和蔬菜中農(nóng)藥多殘留的快速篩查提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290 Infinity II LC-6545 Q-TOF/MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有雙噴射電噴霧電離源(美國Agilent公司), AH-30全自動均質(zhì)儀、Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀、高通量真空平行濃縮儀(中國?？苾x器有限公司), SR-2DS水平振蕩器(日本Tatec公司), KDC-40低速離心機(安徽中佳公司), N-EVAP 112氮吹濃縮儀(美國Organomation Associates公司), Milli-Q超純水機(美國Millipore公司), PL602-L電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

415種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品純度均≥95%(中國阿爾塔科技有限公司);甲酸和乙酸銨均為質(zhì)譜純;乙腈、甲苯為色譜純(美國Fisher公司);乙酸、氯化鈉、無水硫酸鈉和無水硫酸鎂均為分析純(中國安譜公司); Carbon/NH2柱(美國Agilent公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取10 mg(精確至0.01 mg)標(biāo)準(zhǔn)品,置于10 mL棕色容量瓶中,以甲醇定容至刻度,配制單標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-18 ℃避光保存;根據(jù)需要,移取適量儲備液,用甲醇稀釋,配制所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液,于4 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

提取:稱取紫甘藍(lán)樣品10 g,置于80 mL離心管中,加入1%醋酸乙腈40 mL,以13 500 r/min均質(zhì)1 min,加入1 g氯化鈉、4 g無水硫酸鎂,振蕩10 min,以4 200 r/min離心5 min,取上清液20 mL,在37 ℃、150 r/min條件下蒸發(fā)濃縮至約2 mL,待凈化。

凈化:在Carbon/NH2柱中加入約2 cm無水硫酸鈉,將Carbon/NH2柱放到自動固相萃取儀上。用4 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)活化SPE柱,并棄去流出液,每次用2 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)洗滌樣液瓶3次,并將洗滌液移入Carbon/NH2柱中。再用25 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)洗脫,合并洗脫液,置于試管中。在37 ℃、150 r/min條件下蒸發(fā)濃縮至約0.5 mL,并將濃縮液置于氮氣下吹干,加入1 mL乙腈-水(3∶2, v/v)混勻,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后,定容。

1.4 儀器條件

色譜柱:ZORBAX SB-C18柱(100 mm×2.1 mm, 3.5 μm);柱溫:40 ℃;流動相:A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨), B相為乙腈;流速:0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～3 min, 1%B; 3～6 min, 1%～30%B; 6～9 min, 30%～40%B; 9～15 min, 40%B; 15～19 min, 40%～60%B; 19～23 min, 60%～90%B; 23～23.01 min, 90%～1%B; 23.01～27.01 min, 1%B。進樣體積:5 μL。

離子源:雙通路噴射流電噴霧電離(Dual AJS ESI)源;掃描方式:正離子全掃描;全掃描范圍:m/z50～1 000;毛細(xì)管電壓:4 000 V;霧化氣體:氮氣;霧化氣壓力:0.14 MPa;鞘氣溫度:375 ℃;鞘氣流速:11.0 L/min;干燥氣流速:12.0 L/min;干燥氣溫度:325 ℃;碎裂電壓:145 V。

All Ions MS/MS模式條件:0 min時,碰撞能為0 V; 0.5 min時,碰撞能分別為0、15和35 V。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 415種農(nóng)藥的分子式、保留時間(tR)、加合離子、定量離子和定性離子

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

表 1 (續(xù))

2 結(jié)果與討論

2.1 高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的建立

2.2 采集模式的選擇和參數(shù)優(yōu)化

在基于QTOF/MS的高分辨質(zhì)譜中,要實現(xiàn)同時采集獲取一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜信息,可以通過兩種方式實現(xiàn)。一種是數(shù)據(jù)依賴的采集模式,如Auto MS/MS采集模式;另外一種是數(shù)據(jù)非依賴的模式,如All Ions MS/MS采集模式。本文分別對兩種模式下的參數(shù)進行優(yōu)化,并在各自最優(yōu)的條件下進行比較。

2.2.1Auto MS/MS采集參數(shù)的優(yōu)化

Auto MS/MS采集模式中,可以允許系統(tǒng)根據(jù)質(zhì)譜圖中m/z的響應(yīng)強度來自動選擇母離子進行二級質(zhì)譜掃描,同時允許對指定化合物列表優(yōu)先進行二級質(zhì)譜掃描。為了保證優(yōu)化效果,本文根據(jù)農(nóng)藥化學(xué)性質(zhì)分類,選擇PCDL庫中的214種農(nóng)藥放入指定列表,并在其相應(yīng)的保留時間窗口優(yōu)先采集其二級質(zhì)譜圖。在固定標(biāo)準(zhǔn)混合溶液質(zhì)量濃度為100 μg/L條件下,對Auto MS/MS采集模式的參數(shù)進行優(yōu)化。結(jié)果顯示,在固定一級質(zhì)譜采集速率下,隨著二級質(zhì)譜采集速率從2 spectra/s增加到6 spectra/s,篩查出的農(nóng)藥占比逐漸下降,同時假陰性農(nóng)藥的占比逐漸增加,采集速率為2 spectra/s時的篩查結(jié)果相對最佳,篩查出農(nóng)藥占比可以達到79.91%。因此,在采用Auto MS/MS模式時,二級采集速率建議設(shè)定為2 spectra/s，以盡可能提升檢出的農(nóng)藥占比,降低假陰性率。

2.2.2All Ions MS/MS優(yōu)化

數(shù)據(jù)非依賴的All Ions MS/MS模式是近年來發(fā)展起來的一種高效采集模式,采集時無需事先設(shè)置加合離子信息,可以針對采集的數(shù)據(jù),依據(jù)保留時間、加合離子和二級碎片離子的共流出輪廓匹配情況對化合物進行定性。因此,至少需要高低兩個能量通道以滿足定性和定量數(shù)據(jù)的同時采集。碰撞能和采集速率是影響All Ions MS/MS采集模式性能的重要參數(shù),本文分別對二者進行了優(yōu)化。

實驗首先對碰撞能進行了優(yōu)化。在All Ions MS/MS模式中需要設(shè)置碰撞能0 V以獲得化合物的加合離子信息,設(shè)置0 V以上的碰撞能以獲得二級質(zhì)譜的信息。本實驗選擇前述214種代表性農(nóng)藥進行碰撞能優(yōu)化。碰撞能較低時,采集到的碎片離子較少,用于定性的離子可能會偏少,導(dǎo)致定性信息不充分。如果碰撞能較高,化合物的主要定性離子強度降低,同時相對分子量較低的碎片離子增加,而基質(zhì)中的干擾峰通常位于低相對分子質(zhì)量端,這會對化合物的定性產(chǎn)生干擾。因此,本文在固定采集速率為2 spectra/s的條件下,對比了在0 V和15 V雙碰撞能通道下和0、15和30 V三碰撞能通道下,以及0、15和35 V三碰撞能通道下采集所篩出農(nóng)藥和假陰性農(nóng)藥的占比情況(見圖1)?？梢钥闯?在0、15和35 V三碰撞能通道下,可篩查出農(nóng)藥的占比明顯高于其他情況,這主要是因為,同時在0、15和35 V三碰撞能通道下采集,可以使得一些相對穩(wěn)定的化合物產(chǎn)生相對較強的二級碎片離子,有助于對化合物進行同時基于母離子和二級碎片離子的準(zhǔn)確定性。

圖 1 不同碰撞能下準(zhǔn)確篩查出的農(nóng)藥和假陰性農(nóng)藥占比Fig. 1 Percentage of accurately screened and false-negative pesticides using different collision energies

在選定的0、15和35 V三碰撞能通道下,針對這214種農(nóng)藥,對采集速率進行優(yōu)化。圖2給出了2、3、4、5和6 spectra/s等5種采集速率下,篩出農(nóng)藥和假陰性農(nóng)藥的占比情況。從圖2可以看出,對于采集速率2、3和4 spectra/s,隨著采集速率的增加,可篩查出的農(nóng)藥占比增加,采集速率為4 spectra/s時,所有農(nóng)藥均能篩出,但是當(dāng)采集速率設(shè)置為5 spectra/s和6 spectra/s時,可篩出農(nóng)藥數(shù)量的占比有所下降。同時,由于在All Ions MS/MS模式中兩個通道交替采集,采集速率逐漸增加,每個采集點的掃描時間下降,使得加合離子的響應(yīng)逐漸下降,在保證每個色譜峰采集點數(shù)滿足準(zhǔn)確定量的前提下,采集速率為4 spectra/s時的篩查結(jié)果最佳。

圖 2 不同采集速率下準(zhǔn)確篩查出的農(nóng)藥和假陰性農(nóng)藥占比Fig. 2 Percentage of accurately screened and false-negative pesticides using different acquisition rates

2.2.3不同采集模式的比較

在Auto MS/MS和All Ions MS/MS兩種采集模式的最佳條件下,分別對214種農(nóng)藥的篩查情況進行比較。結(jié)果表明,214種農(nóng)藥在All Ions MS/MS采集模式下的篩出農(nóng)藥數(shù)量占比為100%,遠(yuǎn)高于在Auto MS/MS采集模式下的檢出率(79.91%)。結(jié)合前述分析,Auto MS/MS采集模式下的篩出農(nóng)藥占比均低于All Ions MS/MS采集模式任一碰撞能下的檢出率,說明All Ions MS/MS采集模式更加靈敏,假陰性率明顯降低,優(yōu)于Auto MS/MS采集模式。因此,本文選擇All Ions MS/MS采集模式中0、15和35 V三碰撞能通道和采集速率4 spectra/s作為最佳條件,建立紫甘藍(lán)中415種農(nóng)藥的高通量篩查方法。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1線性范圍、篩查限與定量限

稱取6份空白紫甘藍(lán)樣品,按1.3節(jié)描述進行前處理后,分別加入不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,建立基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。應(yīng)用All Ions MS/MS模式測定目標(biāo)化合物,以加合離子的質(zhì)量濃度對其峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,415種農(nóng)藥在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)均高于0.990(見附表1,詳見http://www.chrom-China.com/)。

關(guān)于篩查限(SDL)的確定,參照歐盟指南文件SANTE/12682/2019的要求,在一系列濃度水平上做添加回收試驗，每個水平制備20個平行樣,按照1.3節(jié)描述進行前處理后進行檢測。如果在某添加水平下,某個化合物在19個紫甘藍(lán)樣品中均能被定性篩查出來,則該濃度被確定為該化合物在紫甘藍(lán)中的篩查限。附表1給出了415種農(nóng)藥的篩查限,為1～20 μg/kg,其中411種農(nóng)藥的篩查限小于等于5 μg/kg。

按照1.3節(jié)描述對紫甘藍(lán)樣品進行前處理,向空白樣品中添加不同水平的目標(biāo)化合物,在前述最佳條件下進行測定,以信噪比S/N≥10對應(yīng)的添加水平作為定量限(LOQ),結(jié)果見附表1,紫甘藍(lán)中415種農(nóng)藥的定量限為1～20 μg/kg,其中413種農(nóng)藥的LOQ≤10 μg/kg。

2.3.2回收率與精密度

為了考察方法的準(zhǔn)確度和精密度,對空白紫甘藍(lán)樣品進行添加回收試驗。分別選擇1倍、2倍和10倍LOQ的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液作為添加水平,按前述方法進行前處理,每個添加水平制備5個平行樣品。同時進行空白實驗,扣除本底值后計算添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。紫甘藍(lán)中415種農(nóng)藥在1倍、2倍和10倍LOQ添加水平下的回收率分別為65.7%～118.4%、72.0%～118.8%和70.2%～111.2%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.9%～19.7%、0.2%～19.9%和0.6%～19.9%,結(jié)果見附表1。說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足準(zhǔn)確定量的要求。

2.4 歐盟能力驗證樣品測定

2019年歐盟組織了紫甘藍(lán)中農(nóng)藥殘留檢測的能力驗證,包括定性篩查(EUPT-SM-11)和定量篩查(EUPT-FV-21)兩方面內(nèi)容。將本文建立的篩查方法應(yīng)用于該能力驗證項目提供的紫甘藍(lán)樣品中農(nóng)藥殘留的定性篩查和準(zhǔn)確定量,評估了該方法的定性可靠性和定量準(zhǔn)確性。樣品前處理按照1.3節(jié)描述進行,用All Ions MS/MS模式在最佳參數(shù)條件下進行數(shù)據(jù)采集。

定性篩查EUPT-SM-11未給定紫甘藍(lán)樣品中添加農(nóng)藥的范圍,重點考察篩查出農(nóng)藥的種類,定量僅做參考,而且要求收到樣品72 h內(nèi)上報結(jié)果。結(jié)果顯示,本實驗室應(yīng)用本文開發(fā)的方法篩出了添加的16種農(nóng)藥,沒有假陽性結(jié)果。與歐盟官方最終公布結(jié)果完全一致。

關(guān)于定量篩查EUPT-FV-21,組織方提供了強制和自愿農(nóng)藥清單,要求首先對紫甘藍(lán)中在清單范圍內(nèi)的農(nóng)藥進行篩查,再對篩查出的農(nóng)藥準(zhǔn)確定量。要求檢測范圍覆蓋強制農(nóng)藥清單的90%,檢出所添加農(nóng)藥種類的90%或以上并能準(zhǔn)確定量,并且不能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

應(yīng)用本文建立的方法首先進行定性篩查,準(zhǔn)確篩查出了其中可以采用基于液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)檢測的19種非揮發(fā)性農(nóng)藥,并采用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品進行進一步的準(zhǔn)確定量。結(jié)果表明,本文建立的紫甘藍(lán)中農(nóng)藥多殘留篩查方法定性能力強,沒有假陽性,而且定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠,所有篩查出的化合物的定量結(jié)果均在驗證樣品的標(biāo)準(zhǔn)值允許誤差范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

通過對比不同采集模式,優(yōu)化采集參數(shù),本文應(yīng)用液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜建立了紫甘藍(lán)中415種農(nóng)藥殘留的高通量定性篩查與準(zhǔn)確定量方法。將該方法應(yīng)用于2019年歐盟組織的紫甘藍(lán)中農(nóng)藥殘留能力驗證,結(jié)果表明,基于All Ions MS/MS采集模式的一次進樣便可快速定性和定量的方法,具有非常強的定性篩查能力,同時可以對篩查出的化合物進行準(zhǔn)確定量。該方法具有簡單、快速的特點,適用于對紫甘藍(lán)中多種農(nóng)藥殘留的快速篩查,可以為其他水果蔬菜中農(nóng)藥殘留的高通量篩查提供參考。