張曉瑞 劉曉暉 付 博 楊宗燦 時向東

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南 鄭州 450000；2. 深圳煙草工業(yè)有限責(zé)任公司，廣東 深圳 518000；3. 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南 鄭州 450000)

淀粉是煙葉中重要的有機化合物，其含量過高會產(chǎn)生焦糊氣味以及多種有害成分，對煙草制品的感官質(zhì)量產(chǎn)生不良影響[1-3]。相較于國外優(yōu)質(zhì)煙葉，中國煙葉淀粉含量普遍偏高。研究[4]表明，一定范圍內(nèi)，煙葉感官質(zhì)量隨淀粉含量的下降而提升。因此利用適宜的方法降解煙葉淀粉對提升煙葉品質(zhì)具有重要意義[5]。

大量研究[6-7]表明，微生物法降解煙葉淀粉可顯著提升煙葉品質(zhì)。胥海東[8]利用枯草芽孢桿菌對煙葉進行發(fā)酵，煙葉淀粉降解率達(dá)11.49%，煙葉內(nèi)在品質(zhì)得到改善；陳雨峰等[9]發(fā)現(xiàn)，煙葉經(jīng)不同濃度芽孢桿菌菌液發(fā)酵后，煙葉淀粉含量顯著降低，糖含量和香氣量增加，煙葉品質(zhì)顯著提升。微生物法在降解煙葉淀粉方面應(yīng)用廣泛，但仍存在煙葉淀粉降解率偏低，效果不穩(wěn)定、煙用微生物工業(yè)應(yīng)用技術(shù)缺乏等問題。煙葉發(fā)酵過程中，提高產(chǎn)淀粉酶菌株的酶活可提高煙葉淀粉的降解率[10]，而目前研究多集中于利用誘變、轉(zhuǎn)基因以及選育優(yōu)良菌株等技術(shù)提高菌株酶活性以改善煙葉發(fā)酵效果，其操作方式復(fù)雜且周期較長[11-13]。相對而言，通過產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝優(yōu)化相結(jié)合的方法，不僅能在較短時間內(nèi)提高菌株酶活及煙葉淀粉降解率，而且能夠穩(wěn)定工業(yè)應(yīng)用效果。

文章擬從煙葉表面篩選出本源微生物，通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化菌株產(chǎn)酶條件，利用正交試驗優(yōu)化煙葉發(fā)酵工藝，旨在通過微生物發(fā)酵定向解決煙葉淀粉問題，為提升煙葉品質(zhì)及煙用微生物的工業(yè)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙葉：2019年河南許昌襄縣B2F初烤煙葉；

淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、NaCl 5.0 g、可溶性淀粉20.0 g、瓊脂粉15.0 g，水1 000 mL，pH 7.0；

LB培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、水1 000 mL，pH 7.0；

LB固體培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、瓊脂粉15 g、水1 000 mL，pH 7.0；

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉10.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 3.0 g、水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選

(1) 初篩：參照桑筱筱等[14]的方法并修改，將10 g煙葉置于150 mL滅菌蒸餾水中，35 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h，按10-3，10-4，10-5倍稀釋涂布于LB固體培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落至淀粉培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，滴加碘液，觀察透明圈產(chǎn)生情況，測定各菌株的透明圈直徑/菌落直徑(D/d值)。

(2) 復(fù)篩：將D/d值較大的菌株接種至LB液體培養(yǎng)基，35 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h，將種子液按1%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)，4 ℃、4 000 r/min離心20 min。用pH 7.0的KH2PO4—NaOH緩沖液洗滌菌體沉淀(1 000 mL發(fā)酵液菌體中加入100 mL緩沖液)，超聲波破碎40 min(20 W，間隔4 s，超聲2 s)，4 ℃、8 000 r/min 離心20 min，測定上清液(粗酶液)[15]的淀粉酶活力。

(3) 淀粉酶活力測定：以45 ℃、pH 5條件下，1.0 mL菌株粗酶液每分鐘催化分解淀粉生成1 mg麥芽糖所需酶量定義為1個酶活力單位。

1.2.2 菌株形態(tài)觀察及分子鑒定

(1) 形態(tài)觀察：將HX-6菌株接種至LB固體培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征并對菌株進行革蘭氏染色。

(2) 分子生物學(xué)鑒定：依據(jù)細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取HX-6菌株基因組DNA。以菌株HX-6的基因組DNA為模板，利用引物gyrA-F(5′-CAGTGTTTGATCCTGGCT-3′)和gyrA-R(5′-AGGAGCTGATCCAGCCGCA-3′)擴增gyrA序列。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將gyrA陽性克隆條帶的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測定結(jié)果利用BLAST比對分析，并用MEGA6.0軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確菌株HX-6的分類地位。

1.2.3 HX-6菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化

(1) 碳源種類及質(zhì)量濃度對菌株淀粉酶活力的影響：發(fā)酵培養(yǎng)基中分別以10 g/L的可溶性淀粉、紅薯淀粉、葡萄糖、可溶性淀粉與紅薯淀粉混合粉(m可溶性淀粉∶m紅薯淀粉為1∶1)作為碳源，其他條件不變，測定淀粉酶活力，確定最適碳源。調(diào)整最適碳源質(zhì)量濃度為5，10，15，20，25 g/L，考察碳源最適質(zhì)量濃度對菌株淀粉酶活力的影響。

(2) 氮源種類及質(zhì)量濃度對菌株淀粉酶活力的影響：以質(zhì)量濃度為10 g/L的蛋白胨、NH4NO3、酵母粉、蛋白胨與酵母粉混合粉(m蛋白胨∶m酵母粉為1∶1)作為氮源，其他條件不變，測定淀粉酶活力，確定最適氮源。調(diào)整最適氮源質(zhì)量濃度分別為5，10，15，20，25 g/L，考察最適氮源質(zhì)量濃度對菌株淀粉酶活力的影響。

(3) 無機鹽種類及質(zhì)量濃度對菌株淀粉酶活力影響：分別添加質(zhì)量濃度為3 g/L的NaCl、CaCl2、KNO3、MgSO4作為無機鹽，其他條件不變，測定淀粉酶活力，確定最適無機鹽。調(diào)整最適無機鹽的質(zhì)量濃度分別為1，3，5，7，9 g/L，考察最適無機鹽的質(zhì)量濃度對菌株淀粉酶活力的影響。

(4) 響應(yīng)面優(yōu)化：依據(jù)單因素試驗結(jié)果，以最適碳源、氮源、無機鹽為自變量，采用Design Expert 11軟件對培養(yǎng)基成分進行Box-Behnken響應(yīng)面試驗優(yōu)化。

1.2.4 煙葉發(fā)酵工藝優(yōu)化 參照谷月[16]的方法并修改，煙葉經(jīng)回潮、切絲后制得試驗用長度均勻的煙絲。將產(chǎn)酶優(yōu)化后菌株HX-6的粗酶液均勻噴施于煙絲表面，以煙絲表面噴施同等比例KH2PO4—NaOH緩沖液為對照，無菌水調(diào)整煙葉含水率至18%，于恒溫恒濕箱中進行發(fā)酵。發(fā)酵后煙絲于80 ℃烘箱中干燥5 min，對菌株粗酶液進行滅活。

(1) 發(fā)酵時間對煙葉淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響：將粗酶液按煙絲重量3%的比例均勻噴施于煙絲表面，33 ℃分別發(fā)酵8，16，24，32，40，48 h后測定煙葉淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

(2) 粗酶液添加量對煙葉淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響：將粗酶液分別按煙絲重量1%，3%，5%，7%的比例均勻噴施于煙絲表面，33 ℃發(fā)酵24 h后測定煙葉淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

(3) 發(fā)酵溫度對煙葉淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響：將粗酶液按煙絲重量3%的比例均勻噴施于煙絲表面，分別于23，28，33，38，43 ℃發(fā)酵24 h后測定煙葉淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

(4) 正交優(yōu)化：在單因素試驗基礎(chǔ)上，以煙葉淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，考察發(fā)酵時間、粗酶液添加量、發(fā)酵溫度對煙葉淀粉的降解效果，設(shè)計三因素三水平正交試驗，優(yōu)化發(fā)酵工藝。

1.2.5 常規(guī)化學(xué)成分的測定

(1) 水溶性總糖及還原糖：按YC/T 159—2002執(zhí)行。

(2) 總植物堿：按YC/T 160—2002執(zhí)行。

(3) 總氮：按YC/T 161—2002執(zhí)行。

(4) 淀粉：按YC/T 216—2013執(zhí)行。

1.2.6 感官評價 發(fā)酵煙絲卷制成卷煙，于(22±1) ℃、相對濕度(60±2)%下平衡水分48 h。由河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心組織評吸專家從卷制樣品的香氣質(zhì)(A)、香氣量(B)、濃度(C)、柔細(xì)度(D)、余味(E)、雜氣(F)及刺激性(G)7個方面進行感官質(zhì)量評價。感官評價總分=(A+B)×2.3+C×1.5+D+E+F+G。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 各試驗指標(biāo)均重復(fù)3次，采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，Origin 2019軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉中產(chǎn)淀粉酶菌株的分離與篩選

經(jīng)初步篩選產(chǎn)生透明圈的菌株共有53株，其中D/d值>1.5的菌株10株(見圖1)。由表1可知，菌株HX-6的D/d值最大，初步判斷HX-6菌株淀粉酶活力最高。

圖1 產(chǎn)淀粉酶菌株的透明圈及生長情況

表1 10株淀粉酶產(chǎn)生菌菌株的透明圈直徑與菌落直徑

由圖2可知，菌株HX-6的淀粉酶酶活最大，為38.96 U/mL，因此選擇HX-6為試驗菌株。趙淑琴等[17]從富含淀粉的土壤中篩選出初始酶活為32.5 U/mL高產(chǎn)淀粉酶菌株；聶晶晶等[18]從煙葉表面篩選出一株高效降淀粉的解淀粉芽孢桿菌，其酶活為25.2 U/mL，均低于菌株HX-6的酶活。

2.2 菌株HX-6的形態(tài)與分子學(xué)鑒定

由圖3可知，HX-6菌落呈乳白色，不透明，邊緣不規(guī)則，直徑約4 mm，經(jīng)革蘭氏染色為陽性菌，細(xì)胞形態(tài)呈桿狀。

GyrA序列分析結(jié)果表明，菌株HX-6與枯草芽孢桿菌的同源性達(dá)99%；采用鄰接法構(gòu)建菌株HX-6及其相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明HX-6菌株與枯草芽孢桿菌SRCM101393親緣關(guān)系最近(圖4)。綜合形態(tài)特征和gyrA序列分析結(jié)果，菌株HX-6為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

2.3 HX-6菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 單一碳源、氮源、無機鹽對酶活的影響 由圖5(a)可知，碳源種類對菌株產(chǎn)淀粉酶影響顯著(P<0.05)，相較于單一碳源，可溶性淀粉與紅薯淀粉(m可溶性淀粉∶m紅薯淀粉為1∶1)混合作為碳源時，HX-6菌株淀粉酶活性最高，可能是由于混合培養(yǎng)基中淀粉含量較高，菌株產(chǎn)生的淀粉酶將淀粉水解為葡萄糖，菌體能利用產(chǎn)生的葡萄糖進行增殖，且紅薯淀粉中含有多種礦質(zhì)元素和維生素，這些營養(yǎng)物質(zhì)促使菌體量不斷增加，提高了淀粉酶產(chǎn)量[19]，與代陽等[20]的結(jié)果一致。

圖2 10株淀粉酶產(chǎn)生菌的淀粉酶活力

圖3 菌落形態(tài)特點

圖4 HX-6菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

由圖5(b)可知，無機氮——硝酸銨作為氮源時，菌株HX-6酶活性最低；而有機氮源作為氮源時的產(chǎn)酶效果明顯優(yōu)于無機氮源，這是因為有機氮源含有豐富的氨基酸、維生素及生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)，其中氨基酸可直接參與微生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)氨或脫氨作用，維生素可作為一些酶的輔因子參與胞內(nèi)生命活動，提高菌株產(chǎn)酶效果[21]。相較于單一有機氮源，蛋白胨與酵母粉(m蛋白胨∶m酵母粉為1∶1)混合作為氮源時，HX-6菌株酶活力最高，這是由于酵母粉分子比蛋白胨分子小，更易被菌體吸收，促進菌體生長，蛋白胨則利于菌體穩(wěn)定期的延長，促進菌體代謝及產(chǎn)酶，共同使用時增強了菌株的產(chǎn)酶作用[22-24]。

由圖5(c)可知，以KNO3作為無機鹽時，HX-6菌株淀粉酶活力顯著高于其他處理，其次是MgSO4、CaCl2、NaCl，表明KNO3能顯著提高枯草芽孢桿菌HX-6的酶活，這是由于K+能提高酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，提高酶活性[25]，與丁翠珍等[26]的結(jié)果一致。

2.3.2 碳源、氮源、無機鹽質(zhì)量濃度對酶活的影響 由圖6 可知，隨著碳源(m可溶性淀粉∶m紅薯淀粉為1∶1)質(zhì)量濃度的增加，酶活先升高后降低，當(dāng)碳源質(zhì)量濃度為15 g/L時，酶活最高。當(dāng)?shù)?m蛋白胨∶m酵母粉為1∶1)質(zhì)量濃度為20 g/L時，酶活最高；隨著氮源質(zhì)量濃度的增加，酶活顯著降低，可能是混合氮源濃度過高使培養(yǎng)基滲透壓增加，細(xì)胞脫水或死亡，抑制了酶的表達(dá)。當(dāng)KNO3質(zhì)量濃度為3 g/L時，酶活最高。

2.3.3 Box-Behnken設(shè)計與結(jié)果 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以碳源(m可溶性淀粉∶m紅薯淀粉為1∶1)質(zhì)量濃度、氮源(m蛋白胨∶m酵母粉為1∶1)質(zhì)量濃度、KNO3質(zhì)量濃度為自變量，根據(jù)Box-Behnken中心組合原理設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基。試驗因素水平表見表2，試驗設(shè)計與結(jié)果見表3。

由軟件可得各因素對菌株產(chǎn)淀粉酶酶活(Y)的多元回歸方程為：

Y=66.18+3.00A+4.83B-0.4450C-1.36AB+1.8AC+1.53BC-9.34A2-2.32B2-3.32C2。

(1)

由表4可知，模型P=0.000 8<0.01，表明該數(shù)學(xué)模型選擇恰當(dāng)；失擬項P=0.056 8>0.05，說明試驗無失擬項因素存在，進一步說明模型擬合度良好。決定系數(shù)R2=0.951 1，表明有95.11%的試驗數(shù)據(jù)可用此模型進行解釋，真實值與預(yù)測值之間具有較好的擬合度和可靠度，該方案可行。由F值判斷，各因素對淀粉酶活的影響順序為B>A>C；A、B、A2對菌株酶活影響極顯著(P<0.01)，C2對菌株酶活影響顯著(P<0.05)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計因素水平

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

表4 回歸模型方差分析?

2.3.4 響應(yīng)曲面分析 由圖7可知，碳源質(zhì)量濃度與氮源質(zhì)量濃度、碳源質(zhì)量濃度與KNO3質(zhì)量濃度之間的交互作用影響顯著，氮源質(zhì)量濃度與KNO3質(zhì)量濃度之間的交互作用影響較小。同時影響酶活最顯著的因素是氮源質(zhì)量濃度，表現(xiàn)為其響應(yīng)面弧度變化最大，其次是碳源質(zhì)量濃度和KNO3質(zhì)量濃度。

2.3.5 發(fā)酵最佳培養(yǎng)基確定及驗證 應(yīng)用Design-Expert軟件得到產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最佳配方為碳源(m可溶性淀粉∶m紅薯淀粉為1∶1)質(zhì)量濃度17.0 g/L，氮源(m蛋白胨∶m酵母粉為1∶1)質(zhì)量濃度21.89 g/L，KNO3質(zhì)量濃度2.58 g/L，預(yù)測酶活為66.23 U/mL。經(jīng)3次實驗驗證，得到酶活平均值為(66.82±0.65) U/mL，與理論值基本吻合，說明該回歸方程能比較真實地反映各因素對菌株酶活的影響，且酶活優(yōu)于王越[27]的。

2.4 煙葉發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.4.1 發(fā)酵條件對煙葉淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 由圖8可知，與對照組相比，煙葉經(jīng)粗酶液發(fā)酵后淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降，發(fā)酵32 h時，煙葉淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)由最初的4.85%下降至3.53%，降幅達(dá)27.21%。當(dāng)粗酶液添加量為5%時，煙葉淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降幅度最大，達(dá)27.63%，當(dāng)粗酶液添加量>5%時，淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢平緩，主要是隨著粗酶液添加量的增加，酶與底物反應(yīng)越徹底完全，當(dāng)粗酶液添加量達(dá)到一定值時，酶分子之間互相競爭加劇，過量的酶分子無法與底物接觸，煙葉淀粉降解效果降低。當(dāng)發(fā)酵溫度為28～43 ℃時，煙葉淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低，溫度為33 ℃時煙葉淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，此時淀粉降解率為17.01%；當(dāng)溫度超過38 ℃時，由于發(fā)酵溫度過高，菌株酶活性下降，煙葉淀粉降解效果降低。

圖7 各因素交互作用對酶活的影響

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4.2 正交試驗 以煙葉淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計正交試驗，試驗因素水平表見表5，結(jié)果與分析見表6。

表5 正交試驗因素水平表

表6 正交試驗結(jié)果與分析

由表6可知，煙葉最佳發(fā)酵組合為A1B1C3，即發(fā)酵時間27 h、菌株粗酶液添加量4%、發(fā)酵溫度35 ℃。對最佳發(fā)酵組合進行實驗驗證(n=3)，發(fā)酵后煙葉淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.31%，相較于原煙(淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.85%)淀粉降解率達(dá)31.75%，且高于胥海東[8](11.49%)和馮穎杰等[28](29.84%)的。

2.4.3 最佳發(fā)酵工藝條件下煙葉常規(guī)化學(xué)成分及感官質(zhì)量變化 由表7可知，煙葉經(jīng)粗酶液發(fā)酵后，總糖、還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增加了18.8%，20.2%；總氮和煙堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低，兩糖差顯著降低。杜詠梅等[29]研究表明，提高還原糖相對于總糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、減少兩糖差值，有利于提高煙葉吃味品質(zhì)。

由表8可知，發(fā)酵后煙葉感官質(zhì)量顯著提升，香氣量增加、香氣質(zhì)提升、雜氣減輕、刺激性降低。這是由于微生物發(fā)酵將煙葉淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糖，增加了煙葉中的潛香類物質(zhì)，減少了煙葉的雜氣來源，從而提升了煙葉的工業(yè)可用性[30]；且還原糖等煙葉香氣前體物質(zhì)對感官評價影響顯著，煙葉香氣特性與還原糖呈極顯著正相關(guān)[31-32]。

表7 最佳發(fā)酵工藝下煙葉常規(guī)化學(xué)成分?

表8 最佳發(fā)酵工藝下煙葉感官質(zhì)量?

3 結(jié)論

試驗篩選的枯草芽孢桿菌HX-6具有高效降解煙葉淀粉的功能特性，經(jīng)最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化后菌株HX-6淀粉酶活達(dá)66.82 U/mL，較初始培養(yǎng)條件下的酶活提高了71.51%。煙葉經(jīng)菌株HX-6粗酶液發(fā)酵后，淀粉降解率達(dá)31.75%，煙葉的總糖和還原糖含量顯著增加。發(fā)酵處理后的煙葉感官品質(zhì)顯著提升，香氣量增加、香氣質(zhì)提升、雜氣減輕，工業(yè)可用性增加。后續(xù)將重點研究生產(chǎn)線酶制劑施用技術(shù)及煙葉發(fā)酵控制技術(shù)，為工業(yè)化應(yīng)用提供技術(shù)支撐。