王小咪 呂欣然 白鳳翎

(1. 渤海大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121013；2. 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；3. 國家魚糜及魚糜制品加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧 錦州 121013)

真菌是一類可引起植物、動物和人類疾病的真核微生物。根據(jù)美國農(nóng)業(yè)部[1]估計，世界25%糧食作物在生長或貯藏期間受到霉菌污染。最常用的控制真菌技術(shù)是熱處理和酸基防腐劑處理，控制烘焙產(chǎn)品中霉菌生長常采用紫外線或紅外輻射[2]。一些果汁和茶飲料常采用巴氏殺菌技術(shù)和通過添加丙酸鈣、脫氫乙酸鈉等控制霉菌污染。傳統(tǒng)抗真菌劑被認為是導致真菌耐受性的主要原因，因此，新型生物類抗真菌劑的研發(fā)與制備備受關注。

抗菌肽是一類廣泛存在于自然界具有抗菌活性的小肽類物質(zhì)，許多抗菌肽具有很強的抗真菌活性，即抗真菌肽(Antifungal peptides, AFPs)。根據(jù)結(jié)構(gòu)將AFPs分為4類，第1類是在疏水環(huán)境中形成α-螺旋的線性肽，簡稱α-螺旋肽；第2類是β-片狀結(jié)構(gòu)的肽，簡稱β-片狀肽；第3類是半胱氨酸穩(wěn)定的α-螺旋和β-片層折疊肽，簡稱CSαβ肽；第4類是包含大量的特定殘基和隨機結(jié)構(gòu)小肽的線性肽，簡稱線性肽[3]。依據(jù)來源將其分為植物源性、動物源性和微生物源性AFPs。植物源性AFPs來源植物的塊莖、種子等植物組織中，種類豐富，具有廣譜性、高效性、安全性等特點。

1 植物源性抗真菌肽

目前，學者們已從不同植物中分離純化出一些具有活性的AFPs，表1概括了近20年有關植物源AFPs結(jié)構(gòu)、抑制對象及作用機制等內(nèi)容。

1.1 α-螺旋肽

α-螺旋肽主要包括脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白、α-發(fā)夾蛋白和蛻皮素類抗菌肽。脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(Lipid transfer protein, LTP) 是一類由4個α-螺旋組成的小分子量堿性蛋白質(zhì)。LTP來源廣泛，已從玉米、大麥、菠菜、擬南芥、洋蔥、豇豆、水稻等多種植物中獲得了具有抗真菌活性LTP。Ace-AMP1是一種分離于洋蔥種子的LTP，對番茄早疫病菌、棉花枯萎病菌和棉花黃萎病菌等多種植物真菌具有高效的拮抗活性[26]。Gonorazky等[27]從向日葵種子中分離出一種非特異性LTP (nsLTPs)，命名為Ha-AP10，具有抗茄病鐮刀菌(Fusariumsolanum)的活性，可通過靜電吸附與真菌膜上的磷脂相互作用，滲透進入真菌孢子，達到抗真菌作用。

α-發(fā)夾蛋白是一類含有特征性半胱氨酸的環(huán)螺旋肽。Nolde等[8]從稗草中分離出一種α-發(fā)夾蛋白，命名為EcAMP1，其可進入茄病鐮刀菌細胞內(nèi)并積累在分生孢子(液泡或脂質(zhì)體)囊泡中，從而抑制鐮刀菌的生長。此外，Slavokhotova等[7]從金縷草種子中得到的Sm-AMP-X是一種有效的抗真菌α-發(fā)夾蛋白，其在微摩爾范圍內(nèi)抑制了曲霉(Aspergillus)或尖孢菌霉(Fusariumoxysporium)等植物病原真菌的分生孢子萌發(fā)和菌絲伸長。

表1 植物源AFPs的抗菌活性和作用方式

蛻皮素是一類由1個雙α-螺旋結(jié)構(gòu)、6個穩(wěn)定的二硫鍵和1個必需的C-末端(可確保肽的生物活性和穩(wěn)定性)組成的堿性蛋白，分子量約7 kDa。Segura等[9]從馬鈴薯塊莖中首次分離出一種蛻皮素，命名為Snakin-1，該肽含有63個氨基酸殘基，其在低濃度(<10 μmol/L)時對馬鈴薯和其他植物中的細菌和真菌病原體(如茄病鐮刀菌)均具有拮抗活性。此外，馬鈴薯塊莖組織發(fā)生降解或受到侵襲時，其能表達一種肽Snakin-2，與Snakin-1序列同源性僅為38%。雖然Snakin-2和Snakin-1序列具有顯著性差異，但其抑菌譜相似，對鐮刀菌屬、黑曲霉(Aspergillusniger)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等幾種植物病原菌均具有拮抗活性，Snakin-2的作用靶點是在細胞膜上形成孔洞。其他植物中還發(fā)現(xiàn)了蛻皮素Snakin-Z[10]和Sn2[11]。

1.2 β-片狀肽

β-片狀肽是由多個二硫鍵組成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)肽，具有兩親性，可與真菌細胞膜相互作用。Knottin肽是一種β-片狀肽，含有30個半胱氨酸殘基，具有穩(wěn)定的“打結(jié)”拓撲結(jié)構(gòu)。Gao等[13]從美洲商陸種子中分離并克隆了一種新的抗真菌肽PAFP-S，序列分析表明PAFP-S屬于Knottin型抗菌肽，具有廣譜的抗真菌活性，如對尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)和稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)均具有較強的抑制作用。此外，分離自紫茉莉種子中的抗真菌肽Mj-AMP1和Mj-AMP2與PAFP-S具有相同的半胱氨酸結(jié)構(gòu)[12]，具有57%的序列同源性，并分別含有36，37個氨基酸殘基，其中4個氨基酸殘基不同，3個差異發(fā)生在C-末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域代表了1個β-發(fā)夾序列，稱為γ-核心，常被認為是肽活性的必要結(jié)構(gòu)。

1.3 CSαβ肽

植物防御素是一類CSαβ肽，富含二硫鍵，分子量在5 kDa 左右，由45～54個氨基酸組成，其中含有8個保守的半胱氨酸殘基，其三維結(jié)構(gòu)呈小球形，包括1個α-螺旋和3個反平行的β-折疊片層結(jié)構(gòu)，存在于多種植物組織(種子)中，是生物免疫系統(tǒng)中的重要調(diào)節(jié)因子。

胡蘿卜種子的植物防御素Rs-AFP2是最具特征性的防御素之一，對絲狀真菌具有較強的抑制活性[28]。Thevissen等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Rs-AFP2可作用于白色念珠菌(CandidaAlbicans)細胞壁葡萄糖神經(jīng)酰胺(GlcCer)，增大細胞壁壓力，使胞裂蛋白(septin)錯誤定位和神經(jīng)酰胺積累，抑制其菌絲生長。苜蓿防御素MsDef1也有類似GlcCer抑制禾谷鐮刀菌生長的作用[16]。此外，大麗花防御素Dm-AMP1與真菌膜上甘露糖苷二肌醇磷脂酰神經(jīng)酰胺[M(IP)2C]結(jié)合，可增加敏感真菌膜的通透性，導致鈣離子和鉀離子泄露，達到抑制真菌生長的作用效果[17]。植物防御素不但可以作用于真菌細胞壁和細胞膜，還可作用于胞內(nèi)的一些靶點。

1.4 線性肽

線性肽主要包括具有特定氨基酸殘基的小分子橡膠素和硫蛋白，其具有α和β隨機結(jié)構(gòu)。橡膠素以橡膠蛋白命名，通常由29～45個氨基酸殘基組成，分子量約為4.7 kDa，含有6，8，10個半胱氨酸，其中8個半胱氨酸是最常見的形式。橡膠素具有幾丁質(zhì)結(jié)合特性，因此其作用方式是干擾細胞壁生物合成。Huang等[20]從銀杏葉中分離的一種新型橡膠素銀杏內(nèi)酯GAFP與幾丁質(zhì)相互作用后可抑制多種鐮刀菌生長，如禾谷鐮刀菌和串珠鐮刀菌等。Koo等[23]研究發(fā)現(xiàn)，源自日本牽牛花的Pn-AMP1是一種4.3 kDa半胱氨酸/甘氨酸豐富的抗菌肽，對細胞壁中含有幾丁質(zhì)和缺乏幾丁質(zhì)的真菌均具有較強的抑制活性。其能定位于真菌的隔膜和菌絲頂端，并快速滲透進入真菌菌絲中，使菌絲頂端爆裂，內(nèi)容物泄露，導致真菌死亡。此外，來自芥末的Wj-AMP1[29]、蘇鐵的Cy-AMP1[30]、紡錘樹的Ee-CBP[31]、杜仲的EAFP2[22]和小麥種子中的WAMP-1(a/b)[21]等橡膠素也具有抗真菌活性。

硫蛋白由兩個反平行α-螺旋和一個反平行雙鏈β-片組成，由3個或4個二硫鍵橋連接，形成一個特征穩(wěn)定的γ折疊，分子量約5 kDa，含有高比例的精氨酸、賴氨酸和半胱氨酸，且在中性pH下帶正電荷，廣泛分布在大麥、豇豆等多種植物組織中。硫蛋白是疏水性的，通過疏水性和/或極性殘基與膜元件的相互作用顯示其抗真菌活性，導致真菌細胞膜的溶解[32]。Taveira等[24-25]從辣椒中分離出對念珠菌和釀酒酵母具有抑制作用的抗菌肽CaThi與釀酒酵母質(zhì)膜成分相互作用，改變質(zhì)子梯度，抑制介質(zhì)酸化，增加活性氧，引起氧化應激反應。

綜上，目前分離純化得到的植物源AFPs主要對鐮刀菌屬、釀酒酵母屬、念球菌屬及曲霉屬等真菌具有拮抗活性，其作用方式主要通過膜滲透作用，其中植物防御素類抗菌肽研究得較為深入。

2 植物源性抗真菌肽的作用機理

目前，已從多種植物中獲得具有抗真菌作用的活性多肽。由圖1可知，根據(jù)作用位點的不同，植物源AFPs作用機理大致可以分為以下3類。

2.1 對真菌細胞壁的作用

真菌細胞壁主要由糖基化蛋白、β-葡聚糖及幾丁質(zhì)等成分組成，是AFPs識別真菌細胞的靶點。植物源AFPs作用方式：① 通過與真菌細胞壁最外層的糖基化蛋白相互作用以抑制細胞壁蛋白質(zhì)的合成，導致細胞壁不能維持正常的細胞形態(tài)，如結(jié)構(gòu)多樣化甘露糖蛋白是AFPs準確識別病原菌的靶點。Ibeas等[34]研究表明，煙草抗菌肽osmotin可與細胞壁甘露聚糖相互作用，以促進跨細胞壁的擴散，誘導信號級聯(lián)并激活釀酒酵母中的信息素反應MAPK和應激反應途徑，致使真菌細胞受到損傷。② 通過抑制真菌細胞壁中葡聚糖及幾丁質(zhì)的合成來破壞真菌細胞壁的合成，達到殺菌目的。α-硫蛋白是源自大麥和小麥的一種抗菌肽，可與細胞壁幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖結(jié)合，使真菌生長受到抑制。一些植物類thaumatin型肽被證明具有β-1,3-葡聚糖酶活性，可以水解細胞壁中的葡聚糖成分，使細胞壁合成受阻，導致真菌細胞溶解和死亡。橡膠蛋白中包含幾丁質(zhì)結(jié)合域，可與含有幾丁質(zhì)的真菌相互作用，抑制幾丁質(zhì)的合成，從而破壞細胞壁的完整性。與橡膠蛋白類似的hevein型肽也能抑制含有幾丁質(zhì)的真菌生長。

2.2 對真菌細胞膜的作用

細胞膜是真菌細胞的第二道防線，也是AFPs普遍的作用靶點。大多數(shù)陽離子型AFPs都可作用于真菌細胞膜，從而達到抑菌作用。細胞質(zhì)膜帶有負電荷，有助于AFPs通過靜電作用吸附于細胞膜上，使細胞膜發(fā)生去極化反應，增大細胞膜的通透性，使其形成孔洞，導致鉀離子以及細胞內(nèi)容物外滲而死亡。結(jié)合圖1可知，AFPs可通過“桶式模型”“環(huán)狀孔道模型”“毯式模型”作用于真菌細胞膜。但在實際抗真菌時，植物源AFPs可能同時采用幾種不同機制或者各種機制漸次發(fā)生的方式破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)，從而實現(xiàn)殺菌的目的[35]。

圖1 植物源AFPs的作用機制[33]

2.2.1 桶式模型 AFPs與細胞膜通過靜電作用吸附后，AFPs積聚形成多聚體，垂直插入細胞膜磷脂層內(nèi)，形成類似于木桶的離子孔道，導致細胞內(nèi)容物和鉀離子外流，細胞膜分布不均，引起細胞裂解[36]。許多植物防御素的作用方式是桶式模型，其抗菌作用可分為3個階段：① 通過靜電作用與帶負電荷的真菌膜脂層結(jié)合；② 作用于膜上形成穩(wěn)定的多個通道，帶正電荷的防御素分子或其多聚體則與真菌膜上帶負電荷的磷脂頭部和水分子相互作用，顯著增加生物膜的通透性。③ 通道形成后，防御素進入細胞內(nèi)的同時，其他胞外分子也伴隨進入(如肽、蛋白質(zhì)或無機離子)，而靶細胞的重要物質(zhì)(如鹽離子和大分子)滲出，細胞內(nèi)容物外泄致使靶細胞發(fā)生不可逆損傷而死亡。

2.2.2 環(huán)狀孔道模型 環(huán)狀孔道模型也稱蟲孔模型，是指AFPs的疏水部分與磷脂膜疏水頭部相結(jié)合，隨后AFPs移動引導細胞膜磷脂移動。AFPs疏水端和磷脂頭部一直相結(jié)合，使細胞膜表面疏水區(qū)域產(chǎn)生裂縫，磷脂單分子層逐漸向內(nèi)流動彎曲，形成孔道，改變細胞膜穩(wěn)定性，使細胞無法維持正常的滲透壓，進而凋亡。與桶式模型不同的是，AFPs始終與磷脂膜頭部相結(jié)合，兩者共同形成跨膜孔道。如源自番茄中的一種抗菌肽Sn2，其對釀酒酵母具有拮抗活性，主要作用方式是通過在靶細胞膜上形成孔，使真菌細胞失穩(wěn)，進而凋亡[11]。

2.2.3 毯式模型 毯式模型是AFPs平行排布于細胞膜表面，在電荷作用下以地毯形式覆蓋在磷脂層表面，隨著AFPs積聚增多，被覆蓋區(qū)域細胞膜穩(wěn)定性下降，逐漸變形彎曲，最后導致細胞膜瓦解。Alfred等[37]研究發(fā)現(xiàn)，puroindolines是13 kDa的小麥胚乳堿性蛋白，具有豐富的色氨酸結(jié)構(gòu)域和5個二硫鍵。其在真菌膜上產(chǎn)生孢子，可能是通過地毯狀的機制抑制真菌活性[37]。由于毯式模型主要是在電荷作用下吸附AFPs與真菌膜相互作用，而大部分AFPs都是陽離子性多肽，所以該模型基本上都是與其他作用機制一起作用。

2.3 與真菌細胞內(nèi)靶點的作用

一些AFPs與真菌細胞壁和細胞膜相互作用后，還可與胞內(nèi)多種靶點作用，包括啟動脅迫基因、絮凝細胞內(nèi)含物、抑制DNA或蛋白質(zhì)合成、調(diào)控線粒體等細胞器代謝等方式來發(fā)揮抗菌活性。通常內(nèi)化過程發(fā)生前，AFPs先與細胞壁和細胞質(zhì)膜相互作用，因此，AFPs作用于細胞內(nèi)靶點時，也與真菌細胞壁或細胞膜發(fā)生作用。煙草防御素NaD1和豌豆防御素PsD1可進入真菌細胞并與細胞內(nèi)靶點相互作用。NaD1是煙草花組織的一種高水平表達防御素，主要作用于真菌細胞質(zhì)，使其呈顆粒狀，抑制尖孢鐮刀桿菌、灰霉菌和念珠菌等真菌生長[18]。PsD1的抗真菌活性基于阻斷細胞核上的周期蛋白合成，終止真菌細胞周期，導致真菌細胞凋亡[19]。

綜上，AFPs可通過作用位點的不同使真菌細胞生物活性降低或直接導致細胞裂解死亡，以達到抑菌作用。然而，目前關于植物源AFPs的作用機制研究主要集中于細胞膜上，其他靶點的作用機制還有待深入研究。

3 植物源性抗真菌肽的應用

目前，一些植物源AFPs已被應用于食品和農(nóng)作物等領域，馮林慧[38]將對黑曲霉具有拮抗活性的大豆多肽GAP以食品添加劑的形式應用到海綿蛋糕中，發(fā)現(xiàn)隨著GAP添加量的增加，海綿蛋糕的感官特性和理化特性有一定程度的下降，但抗菌特性顯著增加。此外，更多的學者利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將AFPs轉(zhuǎn)入到小麥、玉米和水稻等農(nóng)作物中，以提高農(nóng)作物對病原真菌的抗性。該策略不僅減少了農(nóng)藥的大量使用，且比傳統(tǒng)的育種方法效率更高。蔣雯等[39]將源自馬鈴薯塊莖的抗菌肽SN1的基因編碼序列克隆至載體pGEX-4T-1上，發(fā)現(xiàn)克隆表達的抗菌肽SN1可顯著抑制禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)和平臍蠕孢菌(Bipolaris)菌絲的生長，其可作為小麥病害抗性育種的潛在基因。Zhang等[40]在玉米泛素啟動子的控制下，將源自小麥胚乳的puroindoline蛋白PINA和PINB導入玉米基因中，可使玉米對異旋孢腔菌(Cochliobolusheterostrophus)產(chǎn)生一定的耐受性，并將癥狀的發(fā)生率降低42%。Chen等[41]利用農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，將苜蓿防御素基因(alfAFP)、水稻幾丁質(zhì)酶基因(CHI)及其結(jié)合基因(CHI-AFP)導入番茄微生態(tài)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對病原菌感染的抗性高于非轉(zhuǎn)基因植株，增強了番茄對灰霉病的抗菌性。

4 結(jié)論

植物源抗真菌肽具有來源廣泛、結(jié)構(gòu)多樣、作用機制復雜等特點，是控制食品和農(nóng)作物等產(chǎn)品感染真菌的重要資源。目前，不同來源的植物源抗真菌肽研究主要集中于抗真菌肽的分離、表達、純化及活性分析方面，有關抗真菌肽的作用機制方面的研究還不夠深入，同時造成其在食品和農(nóng)作物等領域的應用產(chǎn)生了局限性。對于存在的這些問題，期望未來更多的研究集中于植物源抗真菌肽的作用機制和應用等方面，使新型、高效、低毒、廣譜的植物源性抗真菌肽在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥等領域發(fā)揮重要作用。