王 雷, 陳 坤

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 骨病科, 陜西 咸陽, 712000)

股骨頭壞死(ONFH)屬中醫(yī)“骨蝕”“骨痹”范疇，與氣滯血瘀、氣血運行不暢、骨失所養(yǎng)有關(guān)[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)[2]認(rèn)為, ONFH與創(chuàng)傷、勞損、激素、飲酒及放射線等因素相關(guān)。ONFH治療重點在于改善血供、恢復(fù)血運、促使新骨形成，而中藥活血化瘀方治療本病具有一定的優(yōu)勢。臨床研究[3]證實，桃紅四物湯可有效改善血液流變學(xué)及黏滯性，進(jìn)而達(dá)到活血化瘀、改善微循環(huán)的目的。桃紅四物湯作為治療ONFH的經(jīng)典方劑，其療效確切，但藥理機(jī)制尚未完全闡明，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從活性成分、靶點、分子結(jié)合潛力、GO富集分析和KEGG信號通路的角度對其進(jìn)行探析，以期為桃紅四物湯治療ONFH提供新的理論參考。

1 資料與方法

1.1 桃紅四物湯的活性成分及靶點挖掘

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索每味中藥的活性成分，篩選標(biāo)準(zhǔn)為口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18, 獲取符合條件的活性成分。對不滿足篩選要求但含量高或者活性強(qiáng)的活性成分，則予以手動添加。再依據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫將活性成分與潛在靶點逐一配對，然后運用Uniprot數(shù)據(jù)庫篩選物種為“Homo sapiens”的靶點，作為桃紅四物湯活性成分靶點。

1.2 股骨頭壞死相關(guān)靶點獲取

以“femoral head necrosis”“osteonecrosis of the femoral head”為檢索詞，分別從OMIM(http://www.omim.org)、Drugbank(https://www.drugbank.ca/)、Genecards(https://www.genecards.org)數(shù)據(jù)庫中檢索與ONFH相關(guān)的靶點，重復(fù)靶點保留1個，所得靶點即為ONFH相關(guān)靶點。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將桃紅四物湯活性成分靶點與ONFH相關(guān)靶點取交集，并與桃紅四物湯活性成分一一對應(yīng); 采用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖; 將交集靶點輸入到String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/), 物種設(shè)置為“Homo sapiens”, 最低相互作用閾值設(shè)為最高置信度“highest confidence(0.9)”, 得到蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)信息，然后采用Cytoscape3.7.2軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理。以介數(shù)(Betweenness)和自由度(Degree)的均值作為截點，將截點之上的靶點作為關(guān)鍵靶點，并分析其藥理作用。

1.4 分子對接評估結(jié)合潛力

利用Systems Dock Web Site服務(wù)器，將關(guān)鍵靶點與桃紅四物湯的活性成分進(jìn)行分子對接，并對對接分?jǐn)?shù)(Docking score)進(jìn)行分析，評估桃紅四物湯活性成分與靶點間的結(jié)合潛力。

1.5 GO富集及KEGG信號通路富集分析

將篩選出的關(guān)鍵靶點輸入到Metascape數(shù)據(jù)分析平臺進(jìn)行GO生物過程富集和KEGG信號通路富集分析。依據(jù)富集基因數(shù)，選取前20位生物學(xué)過程(BP)、分子功能(MF)、細(xì)胞組成(CC)和KEGG信號通路進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 桃紅四物湯活性成分及靶點

桃紅四物湯活性成分共有730個，以O(shè)B值≥30%, DL值≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，再結(jié)合手動篩選得到69個活性成分，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中將其與潛在靶點逐一配對，重復(fù)靶點僅保留1個，共得到187個靶點。

2.2 股骨頭壞死靶點

從OMIM、Drugbank及GeneCards數(shù)據(jù)庫中分別檢索股骨頭壞死(“Femoral head necrosis” “osteonecrosis of the femoral head”)相關(guān)靶點，重復(fù)靶點保留1個，共得到1 927個相關(guān)靶點。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將187個活性成分靶點與1 927個ONFH相關(guān)靶點進(jìn)行映射，得到共同靶點110個，見圖1。利用Cytoscape3.7.2軟件建立活性成分與靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，共有171個節(jié)點和298條邊，見圖2。位居前3位的活性成分為槲皮素、山奈酚、木犀草素，推測其可能是桃紅四物湯治療ONFH的主要活性成分。

圖1 桃紅四物湯與股骨頭壞死靶點韋恩圖

紫色圓點代表靶點，綠色方點代表活性成分。

為進(jìn)一步研究桃紅四物湯治療ONFH的作用機(jī)制，本研究利用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape3.7.2軟件將110個交集靶點進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，見圖 3。網(wǎng)絡(luò)中所有靶點均可以發(fā)生相互作用，蛋白間相互作用共產(chǎn)生2 113條邊，超過介數(shù)和自由度均值的靶點為血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白介素-6(IL-6)以及成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runx2), 認(rèn)為其可能是桃紅四物湯治療ONFH的主要靶點。

圖3 桃紅四物湯蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 分子對接結(jié)果

在分子對接服務(wù)器中輸入主要靶點的PDB數(shù)據(jù)庫ID, 與桃紅四物湯69個活性成分進(jìn)行對接并評估其活性。結(jié)果有32個對接分?jǐn)?shù)值大于7.00, 其中VEGF有13個、IL-6有8個、Runx2有11個; 有60個對接分?jǐn)?shù)值位于5.10和7.00之間; 有45個對接分?jǐn)?shù)值位于4.26和5.00之間; 小于4.26的有10個。對接分?jǐn)?shù)值大于5.00表示結(jié)合能力較強(qiáng)，大于7.00表示結(jié)合能力很強(qiáng)，提示桃紅四物湯的活性成分與靶點可緊密結(jié)合。見圖4。

圖4 分子對接的對接分?jǐn)?shù)值

2.5 GO富集與KEGG信號通路富集

GO富集分析結(jié)果，見圖5。其中分子功能主要富集在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、類固醇激素受體活性、蛋白激酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、核激素受體結(jié)合等方面。生物過程主要涉及到細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、對類固醇激素的反應(yīng)、細(xì)胞凋亡信號通路等生物學(xué)過程，說明桃紅四物湯可通過調(diào)控多個生物過程治療ONFH。細(xì)胞組成包括核轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、蛋白激酶復(fù)合體、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物、線粒體外膜、細(xì)胞外基質(zhì)等。KEGG信號通路富集分析結(jié)果，見圖6。其中有3條通路與股骨頭壞死密切相關(guān)，分別是VEGF、Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)及 核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B(NF-κB)信號通路，提示桃紅四物湯可通過多途徑作用于ONFH。以JAK/STAT信號通路為例，桃紅四物湯治療ONFH的潛在靶點和作用機(jī)制見圖7。

圖5 桃紅四物湯治療股骨頭壞死關(guān)鍵靶點GO富集分析圖

圖6 桃紅四物湯治療股骨頭壞死關(guān)鍵靶點KEGG通路富集分析圖

圖7 JAK/STAT信號通路圖

3 討 論

桃紅四物湯出自清朝吳謙等所著的《醫(yī)宗金鑒》，由桃仁、紅花、熟地、川芎、白芍、當(dāng)歸組成[4], 具有活血化瘀、消腫止痛及補(bǔ)血和血之效。研究[5]表明，桃紅四物湯具有改善局部血液循環(huán)、消除充血水腫的作用。方中桃仁、紅花活血化瘀; 川芎行氣理血; 熟地滋陰補(bǔ)血; 當(dāng)歸活血補(bǔ)血; 白芍柔肝養(yǎng)血，緩急止痛。全方精煉，組方嚴(yán)謹(jǐn)，諸藥合用，共奏活血化瘀、消腫止痛、補(bǔ)血和血之功，為“瘀去、新生”創(chuàng)造了有利條件。

中藥復(fù)方作為理、法、方、藥中重要的一環(huán)，具有藥味多、靶點多、成分復(fù)雜等特點，因此用傳統(tǒng)方法研究中藥復(fù)方尚有一定難度。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為連接中醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的橋梁，能夠?qū)⒍哂行У厝诤掀饋恚怪兴帍?fù)方的作用機(jī)理從分子水平方面探討成為可能。

中醫(yī)認(rèn)為，血瘀是ONFH的主要病因，治療關(guān)鍵在于活血化瘀?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)[6]認(rèn)為，血瘀主要涉及到微循環(huán)障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凝血與抗凝血以及血小板功能等方面。木犀草素、槲皮素、山奈酚是桃紅四物湯治療ONFH的主要活性成分，研究[7-9]證實槲皮素、山奈酚具有抗炎、抗凝血、改善血流動力學(xué)的作用。同時現(xiàn)代藥理學(xué)研究[10-11]亦表明，槲皮素能抑制凝血酶的活性，防止血液凝固以及形成纖維蛋白凝塊，山奈酚可抑制血栓的形成及血小板的活化。學(xué)者[12]發(fā)現(xiàn)，木犀草素具有舒張血管作用，且為非內(nèi)皮依賴性，其作用機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)鈣釋放以及激活鉀通道相關(guān)。

桃紅四物湯治療ONFH的主要靶點有3個, VEGF是調(diào)控血管形成的關(guān)鍵因子并參與血管重建[13], 可增強(qiáng)血管通透性，使血漿纖維蛋白沉積，為參與血管生成的細(xì)胞提供纖維支架[14]。有動物實驗[15]發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子165(VEGF165)基因能夠顯著促進(jìn)ONFH區(qū)血管新生，為ONFH的修復(fù)創(chuàng)造條件。IL-6是重要的骨代謝調(diào)節(jié)者，可促進(jìn)成骨分化，其機(jī)制與激活JAK/STAT信號通路相關(guān)。Runx2能夠調(diào)控成骨細(xì)胞的分化并促進(jìn)其成熟，對修復(fù)骨壞死作用明顯[16], 同時可調(diào)控骨鈣素的表達(dá)，骨鈣素是評價骨形成的優(yōu)良指標(biāo)[17]。洪郭駒等[18]指出Runx2在ONFH的修復(fù)及重建中扮演重要角色。桃紅四物湯主要通過血管新生、調(diào)節(jié)骨代謝、促進(jìn)成骨分化治療ONFH。

GO富集分析中，分子功能與生物過程富集的結(jié)果與PPI網(wǎng)絡(luò)分析的規(guī)律相一致，所展示的分子功能、生物過程與ONFH發(fā)病機(jī)制相符合; ONFH相關(guān)基因富集于該過程，引起ONFH。富集的基因多為桃紅四物湯相關(guān)基因，提示桃紅四物湯通過調(diào)控該生物過程，以達(dá)到治療ONFH的目的。

KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，與股骨頭壞死明顯相關(guān)的通路有3條。NF-κB信號通路在免疫調(diào)節(jié)與炎癥反應(yīng)中起重要作用，研究[19]指出ONFH與炎性因子密切相關(guān)，當(dāng)炎性因子與受體結(jié)合后, NF-κB從復(fù)合物中釋放出來，激活炎性因子，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)ONFH的發(fā)生、發(fā)展[20]。研究[21]證實，抑制NF-κB表達(dá)可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，其機(jī)制與減少炎性因子釋放有關(guān)。VEGF信號通路在ONFH的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用, VEGF是調(diào)控血管生成的關(guān)鍵因子，為血管生成提供分子靶點[22]。研究[23-24]指出抑制蛋白酪氨酸激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子3(JAK2/STAT3)通路，可促進(jìn)血管生成，改善ONFH區(qū)的微環(huán)境，進(jìn)而對ONFH起到修復(fù)作用，此結(jié)果與翁艷等[25]結(jié)論一致。桃紅四物湯能夠利用多個信號通路產(chǎn)生作用。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對桃紅四物湯治療ONFH成分、靶點間的相互作用進(jìn)行探討，為作用機(jī)制的分析提供了理論依據(jù)，對深入探索桃紅四物湯治療ONFH的機(jī)制具有重要的參考意義。