李洋 刁健 郝昕 馬玲

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

松樹是目前世界上最重要的木材來源物種之一，它在生態(tài)、社會和經(jīng)濟(jì)等方面的價值也得到了極高程度地認(rèn)可，其作為典型綠化樹種[1]，在人類的生活中扮演著重要的角色[2-3]。自然界中松樹的主要威脅之一是來自松材線蟲的侵害[4-5]。對松樹枯萎病(Bursaphelenchusxylophilus)的防控主要運用下列幾種方法[6-8]：殺蟲劑的空中噴灑、藥物熏蒸、病樹的人工清除等。結(jié)合實踐結(jié)果分析可知，合成殺蟲劑的使用可能會產(chǎn)生環(huán)境污染、人類健康受損以及非目標(biāo)生物破壞等惡性影響[9]。目前為止，注射植物殺線蟲劑(主要是阿維菌素類化合物)的防控方法較為安全[10]，可以使松樹免受線蟲的感染。

多種化合物(例如內(nèi)源性物質(zhì)、藥物或其他異源生物等)不能通過被動擴散滲透，他們的生物利用度取決于吸收和外排轉(zhuǎn)運蛋白之間的互相平衡，這些蛋白能夠促進(jìn)生物中的底物在膜上的運動[11-13]，且它們在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和釋放潛在有毒物質(zhì)的生物過程中，起著重要的作用[11-12]。研究表明，有一種針對農(nóng)藥的防御機制與上述作用相似，即由環(huán)境污染物積累所引起的毒性保護(hù)過程，它們作用的發(fā)生與哺乳動物、昆蟲以及植物中的外排轉(zhuǎn)運蛋白有關(guān)[14-15]。ABC載體可以有效地將有害內(nèi)源物質(zhì)以及各種與生長過程無關(guān)的外源物質(zhì)(包括藥物等)從細(xì)胞中排出，并且能夠在生理學(xué)、藥理學(xué)和毒理學(xué)等領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。此外，ABC載體可以與藥物代謝酶發(fā)揮協(xié)同作用，從而保護(hù)生物體免受有毒化合物的侵害[16]。ABC轉(zhuǎn)運蛋白參與了多藥耐藥性的發(fā)展，其作用特點是通過降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，從而阻止各種惡性疾病的成功治療[15，17-21]。涉及多藥耐藥性作用的主要成員分布在ABCB、ABCC、ABCG及其他亞家族。不同成員的表達(dá)之間沒有相關(guān)性，但它們可以在多藥耐藥的作用過程中發(fā)揮協(xié)同作用。本研究中涉及到的蛋白質(zhì)屬于ABCB亞家族。

P糖蛋白(PGP)賦予生物的抗藥耐藥屬性只在一部分基因中表現(xiàn)了出來[12，21-22]。ABC轉(zhuǎn)運蛋白的誘導(dǎo)劑和激活劑分別具有增強外排轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)水平和活性的能力[23]，因而潛在有害化合物進(jìn)入特定靶組織的機會有所降低。目前為止，關(guān)于PGP家族的基因成員已得到了廣泛研究，如MDR1(編碼PGP的基因)中的多個單核苷酸多態(tài)性作用[24]。對PGP家族所展開的研究主要是關(guān)于以下方面：PGP家族涉及到的不同種類神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默癥、帕金森癥和癲癇病[25-26]等。這種ABC轉(zhuǎn)運蛋白積極參與了生理和病理過程，本課題組主要關(guān)注其外排功能的調(diào)節(jié)?；谝陨涎芯楷F(xiàn)狀可知，有關(guān)松材線蟲PGP家族的耐藥性研究較為有限，這導(dǎo)致有關(guān)植物寄生線蟲抗性和代謝過程的研究進(jìn)展緩慢。因此，本研究運用生物信息學(xué)手段，分析了Bx-PGP家族中部分成員的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，旨在為日后線蟲農(nóng)藥的開發(fā)，以及新型預(yù)防技術(shù)的拓展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 Bx-pgp基因家族成員進(jìn)化關(guān)系及理化特性測定

為了了解松材線蟲PGP家族成員信息，從NCBI網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載了相應(yīng)的氨基酸序列。使用MEGA 5.1軟件[27]對氨基酸進(jìn)行了多序列比對，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。在構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹時，相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：鄰接法(NJ)采樣泊松模型，樣本的bootstrap為1 000次迭代。

為了進(jìn)一步驗證各蛋白質(zhì)成員間的進(jìn)化關(guān)系，使用最大似然法(ML)構(gòu)建[27]系統(tǒng)進(jìn)化樹。從Pfam數(shù)據(jù)庫(http：//pfam.xfam.org/)[28]中獲得了Bx-PGP家族中相關(guān)基因的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列，隨后進(jìn)行了多序列比對。用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，包括氨基酸數(shù)量、相對分子質(zhì)量、理論等電點值、脂肪系數(shù)、親水性、分子式、總原子數(shù)和不穩(wěn)定系數(shù)[29]。

1.2 蛋白質(zhì)序列基序分析

通過MEME (http://meme-suite.org/) 方法對蛋白質(zhì)序列的基序進(jìn)行分析，基序序列的功能通過Pfam 數(shù)據(jù)庫獲得 (http://pfam.xfam.org/)。

1.3 疏水性和跨膜螺旋區(qū)域分析

通過ExPASy ProtScale網(wǎng)站(https：//web.expasy.org/protscale/)對蛋白質(zhì)的疏水性進(jìn)行分析。利用TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)[30]對蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域進(jìn)行分析。

1.4 拓?fù)洚悩?gòu)模型預(yù)測

使用Protter網(wǎng)站(http：//wlab.ethz.ch/protter/start/)對蛋白質(zhì)的拓?fù)洚悩?gòu)模型進(jìn)行預(yù)測[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bx-pgp基因家族的鑒定及其理化性質(zhì)

從基因組中鑒定了10個Bx-pgp基因成員，并以Bx-pgp1至Bx-pgp10的順序命名了各基因(表1)。由表1可知，10個相應(yīng)蛋白質(zhì)的長度和相對分子質(zhì)量參數(shù)有著顯著的不同。氨基酸個數(shù)為124～1 417，平均長度為794.9 。相對分子質(zhì)量為13 388.16～160 462.04，平均為89 135.88。這些蛋白質(zhì)的理論等電點為5.39～9.21，脂肪系數(shù)為93.26～109.36。可見，這些蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性發(fā)生了顯著變化。蛋白質(zhì)親水性系數(shù)為-0.236～0.276，除了Bx-pgp3，Bx-pgp6，Bx-pgp9，Bx-pgp10以外，其他蛋白質(zhì)的系數(shù)值均為正數(shù)，表明上述4種蛋白質(zhì)為親水蛋白，其他6種蛋白是疏水蛋白。這些蛋白質(zhì)都包含C、H、N、O和S 5個原子。原子總數(shù)為1 891～22 794個。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為29.48～42.30，其中Bx-pgp3和Bx-pgp10的指數(shù)大于40，表明它們的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，而其他8種蛋白質(zhì)的指數(shù)均小于40，表明其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

表1 Bx-pgp蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

2.2 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹及蛋白質(zhì)基序

通過構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖1A)初步揭示了Bx-PGP部分家族成員的進(jìn)化關(guān)系，并以bootstrap重采樣測試作為該結(jié)果的可靠性基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步揭示NJ模型的可靠性，使用JTT + G + F模型構(gòu)建了ML系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖1B)。由2種發(fā)育進(jìn)化樹的結(jié)果綜合比較可知，這2種模型下的分析結(jié)果具有非常好的一致性。

由表2可見，與預(yù)期相同，Bx-PGP家族中的蛋白質(zhì)，特別是那些具有相似進(jìn)化關(guān)系的蛋白質(zhì)，均含有相同或相似的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域。通過運用MEME方法對序列的詳細(xì)分析，得到了15個保守的蛋白質(zhì)序列基序。隨后，通過Pfam和InterProScan對蛋白質(zhì)序列基序進(jìn)行分析，結(jié)果表明，基序1和基序3具有ABC轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)域，基序5、6、11具有ABC轉(zhuǎn)運蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域，其他基序序列沒有詳細(xì)的功能注釋。

圖1 Bx-pgp部分家族成員的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

表2 Bx-PGP蛋白質(zhì)序列基序分析

根據(jù)Pfam網(wǎng)站對各蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)分析可知，關(guān)注的Bx-PGP家族成員中的蛋白質(zhì)，除Bx-PGP6外，都具有ABC轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)域，這表明他們可能都具有一定程度的轉(zhuǎn)運功能。除基序1、4、6、9、10外,各蛋白序列均具有ABC轉(zhuǎn)運蛋白跨膜螺旋區(qū)域。但Bx-pgp6不含有任何已被注釋的基序序列(圖2)。

圖2 Bx-PGP蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析

2.3 蛋白質(zhì)疏水性

蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果以Bx-PGP1為例對結(jié)果進(jìn)行說明。Bx-PGP1蛋白中的第694位天冬氨酸(D)具有-2.978的低疏水性評分，由此可知它具有很高的親水性。相反，第230位的異亮氨酸(I)具有3.489的較高疏水性得分，表明其更具有疏水性。表3中列出了該家族中10個氨基酸序列的疏水性分析結(jié)果，由該結(jié)果可知，該家族中的蛋白質(zhì)包含多個親水性和疏水性區(qū)域，但是他們的分布和聚集現(xiàn)象并不顯著。

表3 Bx-PGP疏水性

2.4 跨膜螺旋區(qū)域

使用TMHMM網(wǎng)站預(yù)測了Bx-PGP基因家族成員的跨膜螺旋區(qū)域。結(jié)果以Bx-PGP1為例(圖3)。通過分析結(jié)果可知，Bx-PGP4蛋白具有最多的跨膜螺旋區(qū)域片段，共計16個。相反地，Bx-PGP6蛋白不含跨膜螺旋區(qū)域片段。在其余的8個蛋白質(zhì)序列中，跨膜螺旋區(qū)域的長度和片段數(shù)各不相同。下面以Bx-PGP1為例，簡要描述該蛋白質(zhì)序列中跨膜螺旋區(qū)域的分析結(jié)果。在Bx-PGP1蛋白序列中，12個跨膜螺旋區(qū)域片段的起止位置分別是64～86、123～145、195～213、217～239、298～320、325～347、726～748、774～796、854～871、875～897、958～980和990～1 012；膜外部分的起止位置分別是87～122、214～216、321～324、749～773、872～874和981～989；相反，膜內(nèi)部分的起止位置分別是1～63、146～194、240～297、348～725、797～853、898～957和1013～1291。表4列出了其他9個蛋白質(zhì)序列跨膜螺旋區(qū)域片段的詳細(xì)信息。

圖3 Bx-PGP基因家族成員的跨膜區(qū)域預(yù)測結(jié)果

2.5 拓?fù)洚悩?gòu)模型預(yù)測

該家族中基因的拓?fù)漕A(yù)測結(jié)果以Bx-PGP為例(圖4)。由圖4可知，該家族中Bx-PGP3具有最多的N-糖基化位點，共計有8個。相反，Bx-PGP6沒有N-糖基化位點。表5中顯示了該家族中其他9個蛋白質(zhì)的拓?fù)洚悩?gòu)分析結(jié)果。其中，由于分析模型及算法的差異，跨膜螺旋數(shù)量上會出現(xiàn)個別與前文不同的結(jié)果。研究表明，N-糖基化位點的存在對于蛋白質(zhì)的折疊和運輸非常重要。因此，該預(yù)測結(jié)果可以從另一個角度證實筆者的假設(shè)，即Bx-PGP家族成員的耐藥性與藥物流出密切相關(guān)。

1～12表示跨膜螺旋的數(shù)量。

表4 Bx-PGP基因家族成員的跨膜區(qū)域

表5 Bx-pgp蛋白拓?fù)洚悩?gòu)分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

松材線蟲的隱蔽性特征使得其與寄主間的關(guān)系極為復(fù)雜[4，32]。正因為有效控制方法的缺乏，使得它們給林業(yè)領(lǐng)域帶來了不可預(yù)估的損失。研究可知，效果顯著且成本較低的一種方法是對潛在目標(biāo)的發(fā)現(xiàn)和利用[32-33]。真核生物中的PGP家族成員，可以將外源物質(zhì)從細(xì)胞中去除，例如有效降低細(xì)胞中的藥物濃度，這在生物體對藥物的耐受反應(yīng)過程中起著極其重要的作用。隨著生物耐藥性研究進(jìn)展的不斷推進(jìn)，PGP家族成員在耐藥性和新陳代謝等方面的作用也得到了廣泛關(guān)注[16]。植物寄生性線蟲的抗藥代謝反應(yīng)過程是抵抗藥物的主要途徑，因此，對于松材線蟲PGP家族成員功能的研究，將為新型防治技術(shù)手段的開發(fā)提供理論依據(jù)。

本研究對松材線蟲PGP基因家族成員進(jìn)行了多種類型的生物信息學(xué)分析。先后運用鄰接法(NJ)和最大似然法(ML)構(gòu)建了Bx-PGP家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹，從而比較PGP家族中各成員的相似性。通過TMHMM方式對Bx-PGP家族各成員的蛋白序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明各成員編碼的蛋白質(zhì)，包含了多個跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)和核苷酸結(jié)合域(NBD)，因此推測該蛋白家族成員具有物質(zhì)運輸?shù)墓δ?，并具有與其他蛋白及大分子化合物相結(jié)合的屬性[34]。由于親水和疏水蛋白的平衡在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能中起著重要作用，因而，本研究通過對蛋白質(zhì)疏水性分析的探討，分析了Bx-PGP家族成員的結(jié)構(gòu)特點。蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移和定位與其自身結(jié)構(gòu)有著緊密的聯(lián)系，拓?fù)洚悩?gòu)分析結(jié)果可以更直觀地了解PGP家族成員，且分析結(jié)果更易理解。此外，也可以通過此方法對N-糖基化位點進(jìn)行預(yù)測。N-糖基化位點的存在對蛋白質(zhì)的折疊和運輸起著重要作用，這也可以從另一個角度證實筆者的假設(shè)，即Bx-PGP家族成員的耐藥性與藥物流出有著密切聯(lián)系?；趯Φ鞍踪|(zhì)疏水性、跨膜螺旋區(qū)域和N-糖基化位點等性質(zhì)的分析可知，特殊結(jié)構(gòu)的存在可以實現(xiàn)藥物的胞外轉(zhuǎn)運。因此，可以得出這樣一個結(jié)論，Bx-PGP基因家族所表現(xiàn)出的耐藥性可能與其促進(jìn)藥物外排有關(guān)，但是其在多藥耐藥過程中的功能機制仍需要進(jìn)一步的試驗探索。

截至目前，有關(guān)松材線蟲PGP家族成員耐藥性的報道較少。本研究的結(jié)果表明，松材線蟲PGP家族成員可能是控制這種寄生線蟲破壞植物能力的潛在靶標(biāo)。然而，與松材線蟲抗性相關(guān)的其他基因和途徑，仍需進(jìn)一步的探索與發(fā)現(xiàn)。本研究的主要目的在于開發(fā)一種以Bx-PGP蛋白家族為生物防治靶標(biāo)的藥物協(xié)同劑，并為證明其防治效果提供理論依據(jù)。