王 朋，梁勝男，王唯嘉，王 鵬，趙 娟，康曉靜

RNA干擾（RNA interfrence，RNAi）借 助 于內(nèi)源或外源性的雙鏈短小RNA誘發(fā)針對目的基因在mRNA水平上的基因沉默[1]。小干擾RNA（small interfrencing RNA，siRNA）作為一種新近發(fā)現(xiàn)的誘導細胞內(nèi)特定基因沉默的技術(shù)，廣泛應用于基因功能研究[2]。表皮松解性掌跖角化癥（epidermolytic palmoplantar keratoderma，EPPK，OMIM 144200），又稱Vorner型掌跖角化病，為一種常染色體顯性遺傳性皮膚病，具有遺傳異質(zhì)性，多數(shù)EPPK患者的致病基因為角蛋白9（KRT9）[3]。本研究前期通過全基因組外顯子測序結(jié)合連鎖分析發(fā)現(xiàn)一維吾爾族EPPK大家系的致病基因為KRT9R163W，該位點錯義突變可能導致氨基酸163由精氨酸突變?yōu)樯彼?，前期研究已利用蛋白預測軟件預測該突變?yōu)橛泻ν蛔僛4,5]。目前已報道的EPPK研究方向多數(shù)為尋找其致病基因，但其疾病的發(fā)病機制研究較少。本研究從細胞水平上進一步探討KRT9的基因功能，利用siRNA靶向沉默KRT9R163W對HaCaT細胞基因表達，并觀察轉(zhuǎn)染前后細胞骨架的變化，進一步從mRNA水平及細胞的結(jié)構(gòu)上探索EPPK的發(fā)病機制，為EPPK的分子靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

永生化人角質(zhì)形成細胞(HaCaT細胞)（中國科學院細胞研究所）；胎牛血清及二甲基亞砜（DMEM）細胞培養(yǎng)液（上海四季青生物技術(shù)公司），青鏈霉素雙抗液及0.25%的胰酶（上海生工生物工程股份有限公司），siRNA序列（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）試劑盒、TrizolRNA抽提試劑盒及pMD-18T質(zhì)粒（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞的復蘇、培養(yǎng) HaCaT細胞凍存于液氮中，快速解凍法解凍，無菌操作臺進行接種操作。吸管吸出細胞懸液，立即注入離心管，加2 ml含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM，充分混合，低速離心800 r/min，棄上清，測定細胞活力。加入5 ml DMEM完全培養(yǎng)基（含10%FBS，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素）充分吹打混勻，接種至100 ml的培養(yǎng)瓶，置于37℃，5%CO2，相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞的傳代及凍存 選生長融合度為60%～70%的細胞，倒去原有的培養(yǎng)液，吸取適量的PBS加入培養(yǎng)瓶中，輕輕震蕩后棄去，重復1次，以清除血清成分，并利于胰酶消化。加入適量0.25%的胰酶，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，使其充分濕潤，培養(yǎng)箱內(nèi)消化2～3 min。顯微鏡下觀察細胞體積縮小，呈類圓形，細胞間隙增大時，加入適量培養(yǎng)液終止消化。吸取瓶中培養(yǎng)液反復沖洗瓶壁上的細胞層輕輕吹打、混勻，制成細胞懸液，將細胞懸液按1:5分裝到無菌培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，4～6 h后可見細胞貼壁生長，每48 h進行1次換液。

1.2.3 質(zhì)粒的構(gòu)建、擴增、篩選及鑒定 ①載體構(gòu)建：質(zhì)粒載體選用pMD-18T，為一種高效的克隆PCR產(chǎn)物的專用載體，約2690 bp。本實驗主要以pMD-18T質(zhì)粒為載體，將野生型KRT9（K9-WT）和具有R163W突變型KRT9的目的基因通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的方法導進宿主細胞，進行重組、篩選、擴增的過程。連接體系為pMD 18T 0.5 μl，目的DNA 2.5 μl，Solution I 3 μl，16℃過夜連接。②轉(zhuǎn)化及擴增：將連接體系共8 μl加入至100 μl的JM109細胞中，用無菌槍頭輕柔的混勻細胞混合物，42℃加熱45 s，冰上放置1 min，加入890 μl的SOC培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60 min。 取出100 μl的培養(yǎng)物涂于37℃預熱的LB固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素）表面。37℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)（16 h左右）。③篩選及鑒定：在含有氨芐青霉素的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落，計數(shù)白色、藍色菌落。挑選白色菌落進行質(zhì)粒小量抽提方法抽提BAC質(zhì)粒。PCR驗證目的基因序列。

1.2.4 siRNA及細胞轉(zhuǎn)染 在網(wǎng)站上進行特異性序列篩選，將選中的堿基序列隨機重新排列作為陰性對照。在數(shù)據(jù)庫中進行同源性對比，以保證和目的細胞中的基因無同源性，只沉默單一的基因，以此設(shè)計siRNA陰性對照序列。siRNA序列由上海吉瑪制藥有限公司合成。siRNA序列[6]：sense: 5′-GCCCGUUG UUGGAAAUCAUTT-3′，antisense: 5′-AUGAUUUCCA ACAACGGGCTT-3′，KRT9R163WsiRNA序列：sense: 5′-TGCAGGAACTCAATTCTTGUU-3′，antisense: 5′-AACAAGAATTGAGUUCCTGCA-3′，siRNA陰 性對照序列：sense: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUT T-3′，antisense: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。將生長良好的細胞接種至6孔板，每孔板加入2 ml無雙抗培養(yǎng)基，放至培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，準備轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染混合液嚴格按照試劑公司提供說明書進行操作，并在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染細胞分組：①KRT9-wt：野生型KRT9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HaCaT細胞（過表 達KRT9-wt）；②KRT9-R163W：KRT9-R163W突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HaCaT細胞（過表達KRT9-R163W）；③KRT9-wt+siRNA-wt：野生型KRT9質(zhì)粒與野生型siRNA共轉(zhuǎn)染入HaCaT細胞（野生型siRNA特異性抑制KRT9-wt）；④KRT9-wt+siRNAR163W：野生型KRT9質(zhì)粒與突變型siRNA共轉(zhuǎn)染入HaCaT細胞（siRNA-R163W能否特異性抑制KRT9-wt）；⑤KRT9- R163W +siRNA- wt：突變型KRT9質(zhì)粒與野生型siRNA共轉(zhuǎn)染入HaCaT細胞（siRNA- wt能否特異性抑制KRT9- R163W）；⑥KRT9- R163W + siRNA- R163W：突變型KRT9質(zhì)粒與突變型siRNA共轉(zhuǎn)染入HaCaT細胞（突變型siRNA- R163W能否特異性抑制KRT9- R163W）。實驗細胞被每組設(shè)3個復孔。

1.2.5 qPCR檢測與蛋白質(zhì)Western印跡（WB） HaCaT細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與siRNA后，24 h 提取細胞總RNA，48 h后提取總蛋白。qPCR與Western 印跡嚴格按照操作規(guī)范進行。KRT9的qPCR引物：F：5′-CAGGTGAACAGATGTGGTCAA-3′，R: 5′-TTCCA GCTTCCATGCAATCAA-3′。Western印跡 KRT9抗體（abcam公司，英國，ab171966，一抗?jié)舛龋?:1000），β-肌動蛋白（abcam公司，英國，ab8226，一抗?jié)舛龋?:5000）。二抗選用abcam公司鼠/兔抗。

1.2.6 細胞骨架免疫熒光染色 取出6孔板內(nèi)的細胞爬片，用PBS洗滌3次，每次5 min。用3.7%多聚甲醛固定15 min。用PBS振蕩洗滌2次，每次5 min。用0.1 %Triton X-100振 蕩 洗 滌15 min。用PBS振蕩洗滌2次，每次5 min。用1% BSA浸沒爬片，靜置約20 min。加入鬼筆環(huán)肽200 μg/ml震蕩10 min，然后置于4 ℃冰箱約60 min（本步驟及以下步驟避光進行）。用PBS振蕩洗滌4次，每次5 min。加入Hoechst 33258染色液300 wl，室溫靜置15 min。用PBS洗滌4次，每次5 min?？諝飧稍?，抗熒光衰減封片劑封片。在激光共聚焦顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察、攝影。

1.3 統(tǒng)計學方法

qPCR結(jié)果通過PCR儀系統(tǒng)軟件計算出△CT，△△CT和mRNA相對表達量（RQ-2-△△Ct）。WB結(jié)果使用Image J軟件分析出其灰度值。數(shù)值資料多組比較選用方差分析，P＜0.05具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒、siRNA轉(zhuǎn)染

質(zhì)粒及siRNA轉(zhuǎn)染效率為熒光細胞總數(shù)/細胞總數(shù)，質(zhì)粒及siRNA轉(zhuǎn)染效率均＞75%（圖1），符合實驗標準。

2.2 KRT9 mRNA表達

qPCR的結(jié)果顯示，KRT9-R163W組及KRT9-R163W +siRNA- R163W組，KRT9 mRNA的 相 對表達量分別是1.063±0.159，0.242±0.051，也就是說在針對突變位點設(shè)計的siRNA能顯著抑制KRT9 mRNA R163W的相對表達量（P＜ 0.05）（表1）。

表1 KRT9 mRNA的表達 （±s）

分 組 2-△△Ct F值 P值 組間P值KRT9-wt 1.011±0.068452.23＜0.05 KRT9-R163W 1.063±0.159 ＜0.05 KRT9-wt+siRNA-wt 0.340±0.063 ＜0.05 KRT9-wt +siRNA-R163W 0.992±0.069 ＜0.05 KRT9- R163W +siRNA-wt 0.329±0.778 ＜0.05 KRT9- R163W +siRNA- R163W 0.242±0.051 ＜0.05

2.3 Western印跡檢測KRT9蛋白表達水平

Western印跡檢測角質(zhì)形成細胞的KRT9表達，KRT9-R163W組 及KRT9- R163W +siRNA-R163W組，KRT9蛋白的相對表達量分別是1.1329±0.131，0.289±0.036。針對突變位點設(shè)計的siRNA能顯著抑制KRT9R163W蛋白的相對表達量（P＜ 0.05）（表2，圖2）。

圖2 KRT9蛋白表達電泳圖

表2 WB結(jié)果分析灰度值 （±s）

表2 WB結(jié)果分析灰度值 （±s）

分組 蛋白相對表達量 F值 P值 組間P值KRT9-wt 1.362±0.176356.04＜0.01 KRT9-R163W 1.132±0.131 KRT9-wt+siRNA-wt 0.337±0.112 ＜0.01 KRT9-wt +siRNA-R163W 1.251±0.071 KRT9- R163W +siRNA- wt 0.389±0.108 ＜0.01 KRT9- R163W +siRNA- R163W 0.289±0.036 ＜0.01

2.4 細胞骨架結(jié)構(gòu)變化

KRT9R163W高表達時，細胞骨架結(jié)構(gòu)為錯綜復雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且部分細胞骨架結(jié)構(gòu)消失。siRNA特異性沉默KRT9R163W基因后，細胞骨架結(jié)構(gòu)恢復正常的束狀排列（圖3）。

圖3 細胞siRNA轉(zhuǎn)染前后HaCaT細胞骨架變化（共聚焦顯微鏡）

3 討論

EPPK為常染色體顯性遺傳病，臨床癥狀主要為出生后數(shù)月內(nèi)出現(xiàn)掌跖部的角化過度性斑塊。組織病理特征性表現(xiàn)為表皮內(nèi)出現(xiàn)空泡化細胞，電鏡下顯示表皮上基底棘層和顆粒層的角質(zhì)形成細胞可見角蛋白和張力絲的異常聚集物。目前，國內(nèi)外已有超過20余種的致病基因突變位點報道，但對致病基因突變所致的細胞結(jié)構(gòu)影響的發(fā)病機制研究較少[7]。本研究利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及siRNA轉(zhuǎn)染入正常HaCaT細胞，使得KRT9R163W在HaCaT細胞中分別呈高表達及低表達狀態(tài)，探討其對細胞骨架結(jié)構(gòu)的影響。HaCaT細胞為一種永生化的人角質(zhì)形成細胞，遺傳特性穩(wěn)定，為研究角蛋白基因突變相關(guān)疾病的理想體外模型。質(zhì)粒攜帶綠色熒光，siRNA攜帶紅色熒光，轉(zhuǎn)染入HaCaT細胞48 h后可在熒光顯微鏡下直觀檢測其轉(zhuǎn)染效率，與陰性對照相比較，質(zhì)粒及siRNA的轉(zhuǎn)染效率均＞75%。通過構(gòu)建含有KRT9R163W突變質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入HaCaT細胞，KRT9R163WmRNA相對表達量顯著增高， KRT9R163W呈高表達狀態(tài)。共聚焦顯微鏡下觀察HaCaT細胞骨架結(jié)構(gòu)呈雜亂狀態(tài)，部分細胞骨架結(jié)構(gòu)消失。利用siRNA靶向沉默KRT9R163W的突變表達，KRT9R163W mRNA相對表達量顯著降低，HaCaT細胞骨架結(jié)構(gòu)部分恢復正常。研究結(jié)果提示，KRT9R163W高表達時可破壞細胞的正常骨架結(jié)構(gòu)，KRT9R163W低表達時細胞的正常骨架結(jié)構(gòu)不受影響。角質(zhì)形成細胞的細胞骨架結(jié)構(gòu)主要是由微絲、微管和中間絲結(jié)構(gòu)組成。正常生理狀態(tài)下，角蛋白9（Keratin9，K9）與配對的堿性蛋白角蛋白（Keratin1，K1），形成K9/K1異源二聚體，K9/K1是形成中間絲的重要結(jié)構(gòu)。Dun 等利用K9基因敲除小鼠模型進一步驗證Krt9-/-小鼠具有與表皮松解性掌跖角化癥相同的臨床表型。免疫組化染色結(jié)果提示K9的完全敲除可引起K6及K16的代償表達，此研究提示內(nèi)源性K9是維持角質(zhì)形成細胞的正常蛋白[8]。KRT9R163W突變表達導致K9第163位精氨酸（arginine）被色氨酸（tryptophan）替代，此突變位點位于K9的1A區(qū)域，多個物種的氨基酸序列比較，此區(qū)域是K9的保守區(qū)域，具有高度保守性，推測此區(qū)域突變可能是K9的功能區(qū)[5]。K9發(fā)生突變后可能會影響異源二聚體的形成，進而影響細胞的結(jié)構(gòu)。本研究通過抑制正常角質(zhì)形成細胞中KRT9，通過siRNA抑制后正常的細胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂，進一步說明K9是維持角質(zhì)形成細胞的重要結(jié)構(gòu)。其編碼的KRT9基因發(fā)生突變，可能影響正常角質(zhì)形成細胞的骨架結(jié)構(gòu)，推測KRT9R163W突變表達可能是導致該病發(fā)病的理論基礎(chǔ)。

siRNA利用外源性核苷酸序列特異性沉默目的基因的表達，廣泛應用于單基因疾病的致病基因研究[7-11]。本研究通過針對KRT9R163W突變位點設(shè)計的siRNA，運用這一新方法驗證KRT9R163W mRNA在HaCaT細胞中表達被抑制。 siRNA能夠有效的在細胞模型中抑制其表達，說明K9是維持人表皮功能正常表達的關(guān)鍵因素，可為EPPK的分子靶向治療提供新的思路。本研究進一步說明siRNA技術(shù)可適用于EPPK致病基因功能驗證及基因治療。EPPK為單基因遺傳病，是由一個致病基因突變所導致的臨床表型，并且存在突變熱點，EPPK少見隱性純合突變或缺失基因功能突變（loss of function mutation）的研究報道。針對EPPK的致病基因設(shè)計siRNA轉(zhuǎn)染入細胞中，可特異性的沉默致病基因的表達，為其分子靶向治療提供新的方向。EPPK主要表現(xiàn)為掌跖部的角化過度，皮損較為局限，理論上可利用siRNA轉(zhuǎn)染入較為局限的皮損內(nèi)達到其治療效果。抑制KRT9R163W突變表達可能成為治療EPPK的一個新的治療方向。siRNA技術(shù)目前已應用于部分角蛋白相關(guān)性疾病的基因功能驗證及基因治療研究，如先天性厚甲癥，單純型大皰性表皮松解癥及先天性角膜營養(yǎng)不良等相關(guān)角蛋白疾病，已處于Ⅰ期臨床研究階段[6,12,13]。利用RNAi技術(shù)，可有效地沉默EPPK的體外模型HaCaT細胞中KRT9R163W基因的表達，為進一步探索KRT9R163W基因在EPPK發(fā)生發(fā)展中的重要作用奠定了基礎(chǔ)，并為在EPPK的治療中尋找更有效的治療靶點提供新的思路。