付偉，楊群，薄雯映，沈華*（1.湖北金貴中藥飲片有限公司，武漢 430051；.九州通醫(yī)藥集團(tuán) 九信（武漢）中藥研究院有限公司，武漢 430050）

天麻為蘭科屬植物天麻Gastrodia elataB1.的干燥塊莖，是我國(guó)傳統(tǒng)珍貴藥材之一，具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽(yáng)和祛風(fēng)通絡(luò)的作用，常用于治療小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐、頭痛眩暈、手足不遂、肢體麻木和風(fēng)濕痹痛等癥[1]，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品[2]，其炮制方法最早記載于《雷公炮炙論》[3]：“修事天麻十兩，焙之，細(xì)剉，單搗然用”。2020年版《中國(guó)藥典》[1]收載的天麻，其飲片【炮制】項(xiàng)下規(guī)定天麻的加工方式為采挖，清洗，蒸透，干燥，潤(rùn)透，切片，干燥。該方法操作復(fù)雜，過(guò)程重復(fù)，耗時(shí)費(fèi)力，有效成分損失較大，制成的飲片質(zhì)地堅(jiān)硬，易變色，且氣味特異或有酸味，嚼之有黏性，需蒸煮服用，食用不便，采用真空冷凍干燥方法處理可以有效地解決上述問(wèn)題。真空冷凍干燥方法的加工過(guò)程為將采挖的鮮藥材洗凈后直接放入低溫下冷凍，當(dāng)樣品完全冷凍后抽真空，低溫干燥。由于整個(gè)過(guò)程都是在低溫條件下進(jìn)行，能夠較好地保留藥材的外觀品質(zhì)、顏色、氣味，同時(shí)使有效成分保留率高，溶出速度快，開(kāi)袋即食，使用方便，具有較好的發(fā)展前景[4-7]。大量試驗(yàn)表明，預(yù)凍時(shí)間、預(yù)凍溫度、干燥溫度、一次干燥時(shí)間等因素均可影響凍干樣品的質(zhì)量[8-11]。本試驗(yàn)擬用Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)方法，以浸出物、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇及巴利森苷類含量的綜合評(píng)分作為指標(biāo)，考察預(yù)冷凍時(shí)間、干燥溫度、一次干燥時(shí)間3 個(gè)因素對(duì)天麻真空冷凍干燥工藝的影響，優(yōu)選天麻凍干工藝。

1 材料

1.1 試藥

天麻素（批號(hào)：110807-201809，純度：96.7%）、對(duì)羥基苯甲醇（批號(hào)：111970-201702，純度：99.4%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；巴利森苷A（批號(hào)：PS011129，含量＞98.0%）、巴利森苷B（批號(hào)：PS011138，含量＞98.0%）、巴利森苷C（批號(hào)：PS011140，含量＞98.0%）、巴利森苷E（批號(hào)：PS190918-01，含量≥98.0%）（成都普斯生物科技股份有限公司）；甲醇、乙腈均為色譜級(jí)，乙醇、磷酸均為分析級(jí)，水為超純水。

鮮天麻由金寨九州天潤(rùn)中藥產(chǎn)業(yè)有限公司提供，經(jīng)九信（武漢）中藥研究院有限公司吳衛(wèi)剛高級(jí)工程師鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elataB1.的干燥塊莖。

1.2 儀器

LGJ-10E 型冷凍干燥機(jī)[四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展（北京）有限公司]；1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；UPT-11-10T 優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)指標(biāo)成分的測(cè)定

2.1.1 浸出物測(cè)定 天麻浸出物的測(cè)定方法參照2020年版《中國(guó)藥典》通則2201 項(xiàng)下熱浸法測(cè)定[12]，浸出物溶劑為稀乙醇。

2.1.2 含量測(cè)定 天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E指標(biāo)成分的測(cè)定方法參照2020年版《中國(guó)藥典》天麻項(xiàng)下特征圖譜的方法測(cè)定[1]，天麻樣品與混合對(duì)照品的HPLC 對(duì)比鏡像圖見(jiàn)圖1。

圖1 天麻樣品與混合對(duì)照品HPLC 鏡像圖Fig 1 HPLC mirror image of Gastrodiae Rhizoma sample and mixed reference substance

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)選天麻冷凍真空干燥工藝

根據(jù)前期試驗(yàn)，選擇預(yù)凍時(shí)間（A）、干燥溫度（B）和一次干燥時(shí)間（C）3 個(gè)因素為響應(yīng)面法考察因素，以浸出物、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇含量及巴利森苷類含量的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù) Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以單因素的最佳值為中心，上下區(qū)域各給定1 個(gè)水平值，該3 個(gè)值作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平，設(shè)計(jì)3 因素3 水平17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析，其中零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5 次，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)結(jié)果采用 Design-Expert 11 軟件進(jìn)行回歸分析，優(yōu)化天麻的真空冷凍干燥工藝。

表1 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中的因素及水平Tab 1 Factors and levels of the Box-Behnken design

3 結(jié)果與分析

3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

由于響應(yīng)面試驗(yàn)使用的評(píng)價(jià)指標(biāo)數(shù)量較多，為盡可能客觀地反映各個(gè)因素之間的關(guān)系及各個(gè)因素水平對(duì)天麻真空冷凍干燥工藝的影響，擬采用綜合加權(quán)評(píng)分法，將各個(gè)指標(biāo)以一個(gè)綜合指標(biāo)（OD）的形式綜合考察，以綜合指標(biāo)進(jìn)行直觀分析。根據(jù)各指標(biāo)成分的重要性，確定浸出物（x1）與對(duì)羥基苯甲醇（x3）的權(quán)重系數(shù)均為0.1，天麻素（x2）的權(quán)重系數(shù)為0.3。巴利森苷類（x4）由于成分較多，權(quán)重系數(shù)為0.5。綜合評(píng)分（OD）＝0.1x1/x1max＋0.3x2/x2max＋0.1x3/x3max＋0.5x4/x4max。Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

3.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

采用Design-Expert 11 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行模型擬合，擬合分析結(jié)果見(jiàn)表3，由結(jié)果可知該模型適合采用二次方程。以浸出物、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 含量的綜合評(píng)分為響應(yīng)值，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合后，各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響可以用回歸方程表示為：Y1＝0.8556 ＋0.0148A＋0.0648B＋0.0448C＋0.0443AB－0.0862AC＋0.0158BC－0.1402A2－0.0267B2－0.0427C2。方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Tab 2 Design and data of the Box-Behnken test

表3 多種模型擬合分析Tab 3 Multiple model fitting analysis

由表4可知，回歸方程使用的模型P＜0.0001，表明此模型有效可靠。失擬項(xiàng)是用來(lái)表示模型與試驗(yàn)擬合的程度，本次模型的失擬項(xiàng)P值為0.0706＞0.05，表明該模型無(wú)失擬因素存在，模型與實(shí)際值能較好地?cái)M合。R2＝0.9909，說(shuō)明該模型能解釋99.09%響應(yīng)值的變化；R2Adj＝0.9792，說(shuō)明可信度較好，可以運(yùn)用該模型分析。

該模型中，干燥溫度（B）、干燥時(shí)間（C）、預(yù)凍時(shí)間-干燥時(shí)間（AB）、預(yù)凍時(shí)間-干燥溫度（AC）、A2、C2極顯著；干燥溫度-干燥時(shí)間（BC）、預(yù)凍時(shí)間（A）、B2顯著；說(shuō)明在綜合評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)的情況下，各影響因素之間不僅存在線性關(guān)系，還存在交互影響。不同考察因素與綜合評(píng)分的響應(yīng)面分析見(jiàn)圖2～4。圖2及圖3的響應(yīng)面圖坡度較陡，表明預(yù)凍時(shí)間與干燥時(shí)間、預(yù)凍時(shí)間與干燥溫度交互作用較強(qiáng)，對(duì)綜合評(píng)分的影響顯著。圖4的響應(yīng)面圖坡度平緩，表明干燥時(shí)間與干燥溫度的交互作用較弱，對(duì)綜合評(píng)分的影響較小。

根據(jù) Design-Expert 11.0 軟件計(jì)算結(jié)果分析可知，天麻凍干的最佳工藝為預(yù)凍時(shí)間10 h，干燥時(shí)間18 h，干燥溫度47.2℃，理論計(jì)算得分為0.915，為方便試驗(yàn)操作，將最佳工藝調(diào)整為冷凍10 h，在溫度45℃條件下干燥 18 h。

3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

表4 回歸模型方差分析結(jié)果Tab 4 Variance analysis in regression model

圖2 預(yù)凍時(shí)間和一次干燥時(shí)間及其交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的等高線圖和三維曲面圖Fig 2 3D response surface plot and contour plot of pre-freezing time and primary drying time

圖3 預(yù)凍時(shí)間和干燥溫度及其交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的等高線圖和三維曲面圖Fig 3 3D response surface plot and contour plot of pre-freezing time and drying temperature

通過(guò)Box-Behnken 試驗(yàn)確定天麻凍干的最佳工藝為冷凍 10 h，在溫度45℃條件下干燥 18 h，在此凍干條件下，預(yù)估天麻的浸出物含量為35.0%，天麻素含量為0.44%，對(duì)羥基苯甲醇含量為 0.02%，巴利森苷類含量為 3.58%。稱取天麻鮮品 3 份，每份 700 g，按照最優(yōu)的工藝制備樣品，測(cè)定其含量，驗(yàn)證凍干工藝的可行性。結(jié)果顯示天麻浸出物的含量平均為34%，天麻素的含量平均為0.45%，對(duì)羥基苯甲醇的含量平均為0.03%，巴利森苷類的含量平均為3.57%，與預(yù)估值基本一致。說(shuō)明該回歸模型可信度高，預(yù)測(cè)效果較好，具有可重復(fù)性和可操作性，可用于天麻凍干飲片制備。

圖4 干燥溫度和一次干燥時(shí)間及其交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的等高線圖和三維曲面圖Fig 4 3D response surface plot and contour plot of drying temperature and primary drying time

4 討論

天麻素、對(duì)羥基苯甲醇為天麻的主要有效成分，具有抗抑郁、鎮(zhèn)靜催眠、降壓等作用[13-18]。2020年版《中國(guó)藥典》將天麻素與對(duì)羥基苯甲醇含量之和列為控制指標(biāo)，評(píng)價(jià)天麻的質(zhì)量。研究表明[19-22]，天麻中亦含有大量的巴利森苷類化合物，該類化合物可以明顯改善大腦的學(xué)習(xí)記憶，具有抗抑郁、抗衰老等藥理作用，是天麻的重要成分。為了更有效、客觀地評(píng)價(jià)各因素對(duì)真空冷凍干燥工藝條件的影響，本文以浸出物、天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷 E 的含量作為優(yōu)化天麻真空冷凍干燥工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

通過(guò)前期試驗(yàn)確定預(yù)凍時(shí)間、干燥時(shí)間和干燥溫度3 因素對(duì)天麻質(zhì)量影響較大，故選擇該3個(gè)因素作為Box-Behnken 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素，確定天麻的最佳真空冷凍干燥工藝條件為：預(yù)凍時(shí)間 10 h，干燥溫度45 ℃，干燥時(shí)間 18 h。凍干工藝得到的天麻產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，可以有效防止藥效成分在干燥過(guò)程中被分解，同時(shí)最大限度地保留了產(chǎn)品原有的色、香、味，而且在生產(chǎn)過(guò)程中沒(méi)有添加任何防腐劑，保證了產(chǎn)品的食用安全性，極大地提高了產(chǎn)品的商業(yè)價(jià)值。

由于凍干天麻含水量低，在高濕條件下易吸潮變色，不易保存，故對(duì)包裝要求比較高，前期摸索發(fā)現(xiàn)鋁箔材質(zhì)及低溫條件下可以較好地防止凍干天麻吸水受潮，后期將會(huì)開(kāi)展凍干天麻的儲(chǔ)藏期試驗(yàn)，擬尋找凍干天麻的最適包裝及最佳儲(chǔ)存條件，為凍干天麻工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。