劉松格 谷見法 潘瓊

（鄭州市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 鄭州 467000）

胃癌是世界范圍內(nèi)死亡率第二的惡性腫瘤，其中約90%為腺癌[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年因胃癌死亡的人數(shù)（約700,000人）占所有惡性腫瘤死亡人數(shù)的10.4%[2]。近年來，胃癌的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢，全球每年約有930,000的新發(fā)病例[1,2]。

目前，手術(shù)仍然是胃癌治療的主要方法。然而，大多數(shù)患者在確診后已經(jīng)處于晚期，無手術(shù)指征，對于這部分患者，化療仍然是最重要的治療手段[3]。此外，對于相當(dāng)一部分行根治性胃癌切除術(shù)的患者，術(shù)前的新輔助化療及術(shù)后的輔助化療仍然發(fā)揮著重要的作用。但是，盡管許多化療藥物在臨床前實(shí)驗(yàn)中能夠很好的殺傷腫瘤細(xì)胞，劇烈的毒副作用大大限制了其臨床應(yīng)用[4]。

納米醫(yī)學(xué)是近年來新興的一門邊緣學(xué)科，納米藥物能夠利用腫瘤組織和正常組織在血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙上的差異，通過增強(qiáng)的滲透與滯留效應(yīng)特異性地在腫瘤組織富集，大大提高了惡性腫瘤治療的效果并降低了治療相關(guān)的毒副作用[5-7]。目前，在常用的納米載藥體系中，脂質(zhì)體的研究和應(yīng)用最為成熟[5]。本研究通過薄膜水化法，制備出了一種靶向表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）的紫外線反應(yīng)性的脂質(zhì)體，其具有較好的穩(wěn)定性和組織相容性，能將負(fù)載的化療藥物靶向輸送至腫瘤組織，在體內(nèi)、外研究中顯示出很強(qiáng)的腫瘤殺傷效應(yīng)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

1 材料方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃腺癌細(xì)胞株NCI-N87（以下簡稱N87）購自美國模式培養(yǎng)物保藏所，保存于本實(shí)驗(yàn)室。細(xì)胞用含10%胎牛血清（GIBCO公司）的伯克改良伊格爾（Dulbecco modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)基（GIBCO公司）于37℃，含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）購自碧云天生物技術(shù)研究所；聯(lián)乙炔基甘油磷脂酰膽堿（Diacetylenic glycerophosphatidylcholine，PC）和mal-PEG購自美國Avanti Polar Lipids公司；西妥昔單抗（Certuximab）購自羅氏制藥股份有限公司；鹽酸多柔比星（Doxorubicin，DOX）購自大連美侖生物科技有限公司；CCK-8（Cell Counting Kit-8）細(xì)胞增殖與活性檢測試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所（DOJINDO）。

1.3 負(fù)載多柔比星的光敏納米脂質(zhì)體的制備

1.3.1 Certuximab Fab’片段的制備及硫醇化修飾

參照Gao等人的方法[8]制備Certuximab的Fab’片段并進(jìn)行硫醇化修飾。將濃度為10 g?kg-1的Certuximab與胃蛋白酶于37℃共育6 h后，用葡聚糖凝膠層析柱（Sephadex G-150 column）進(jìn)行純化，將得到的Certuximab的F(ab)2片段再用木瓜蛋白酶進(jìn)行水解，同樣的方法進(jìn)行純化，得到抗體的Fab’片段。將Certuximab的Fab’片段與2-亞氨基噻吩（2-iminothiolane，2-IT，Sigma-Aldrich公司）按照質(zhì)量比1:0.15的比例混合，室溫下輕輕振蕩反應(yīng)2 h時(shí)，并用透析法除去游離的2-IT，得到硫醇化修飾的Certuximab的Fab’片段（Fab’-SH）。用同樣的方法制備硫醇化修飾的BSA（BSA-SH）。

1.3.2 負(fù)載多柔比星脂質(zhì)體的制備[5,9]

稱取1.8 mgPC和0.2 mg的mal-PEG，混合溶解于氯仿與甲醛的混合溶液中（V氯仿/V甲醛=1），震蕩混勻后靜置10 min，室溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至溶劑完全揮發(fā)，使磷脂在旋蒸瓶內(nèi)壁形成一層薄膜，后用含0.5 g·kg-1DOX的中性磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffered solution，PBS）溶液在旋蒸瓶中緩慢旋轉(zhuǎn)洗滌，得到負(fù)載DOX的脂質(zhì)體溶液。然后將得到的脂質(zhì)體溶液依次用0.8 μm、0.4 μm和0.2 μm的聚碳酸酯膜緩慢過濾，并用透析法（截留分子量MWCO: 3000 KDa）去除游離的DOX，得到粒徑均勻的脂質(zhì)體。將制備的脂質(zhì)體與1.3.1制備的Fab’-SH或BSA-SH于4℃反應(yīng)過夜后，透析法除去游離的抗體Fab’片段或BSA，得到Fab’或BSA表面修飾的脂質(zhì)體（本文中分別標(biāo)記為PDF和PDB）。

1.3.3 負(fù)載多柔比星脂質(zhì)體的紫外交聯(lián)

將1.3.2制備的脂質(zhì)體用紫外分光光度計(jì)（Stratalinker-UV 1800）照射，以進(jìn)行交聯(lián)。照射條件：紫外波長254 nm，劑量：360 g·kg-1，反應(yīng)循環(huán)數(shù)：20，反應(yīng)條件：4℃[10,11]。將成功制備的載藥納米脂質(zhì)體與透射電鏡下觀察形態(tài)，并用動態(tài)光散射儀檢測其粒徑大小。

1.4 光敏納米脂質(zhì)體的體外穩(wěn)定性檢測

以含50%胎牛血清的DMEM緩沖液在體外模擬人體的血液環(huán)境，將脂質(zhì)體置于其中于37℃進(jìn)行孵育，不同時(shí)間點(diǎn)取出溶液，動態(tài)光散射儀檢測比較脂質(zhì)體的粒徑大小和分散系數(shù)的變化[11]。

1.5 脂質(zhì)體藥物負(fù)載DOX的釋放

取5 ml負(fù)載DOX的脂質(zhì)體溶液，紫外分光光度計(jì)檢測其濃度（C1），將其置于透析膜（MWCO：3000 kDa）內(nèi)，將該體系置于含有500 ml PBS緩沖液的燒杯中避光透析，分別與不同時(shí)間點(diǎn)取燒杯內(nèi)的緩沖液300 μL，紫外分光光度計(jì)于488 nm檢測其中DOX的濃度（C2），然后按照下面的公式計(jì)算從脂質(zhì)體中釋放的DOX的比例[12]：被釋放的多柔比星%=C2×500mlC1×5 ml×100%。

1.6 N87細(xì)胞對脂質(zhì)體藥物的內(nèi)吞能力檢測

取生長對數(shù)期的N87細(xì)胞（5×104），將其分別與濃度為1 g·kg-1的游離DOX，PDB和PDF于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，以不含DOX的DMEM培養(yǎng)基作為陰性對照組，4 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測N87細(xì)胞內(nèi)的平均紅色熒光強(qiáng)度，比較細(xì)胞內(nèi)DOX的含量[13]。

1.7 光敏納米脂質(zhì)體對淋巴瘤細(xì)胞的體外殺傷能力檢測

將生長對數(shù)期的N87細(xì)胞置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)（3000·孔-1），分別向其中加入相應(yīng)濃度的游離DOX、PDB和PDF，不含DOX的DMEM培養(yǎng)基作為陰性對照組（NT），48 h后，向每個(gè)孔中加入CCK-8 10 μL，避光靜置2 h后，micro-plate reader（Thermo Multiskan MK3, Thermo Scientific）讀取每個(gè)孔在450 nm的吸光值（Ab），并按照如下公式計(jì)算細(xì)胞活力[14]：

其中，AbBlank為不含N87細(xì)胞的空白對照孔的吸光值。

1.8 脂質(zhì)體藥物對荷瘤小鼠皮下腫瘤的抑制效果

將16只6周齡雌性BALB/c裸鼠（購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物公司）于無菌條件下飼養(yǎng)至8周齡后，皮下注射1×107的N87細(xì)胞，待小鼠的皮下腫瘤生長至長徑約10 mm后，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為四組，每組4只，分別經(jīng)尾靜脈注射游離DOX、PDB和PDF，每組DOX的劑量為5 g·kg-1，尾靜脈注射等體積的PBS作為陰性對照（隔日1次×3次）。密切觀察小鼠狀態(tài)，每日測量小鼠腫瘤體積。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期（49 d）結(jié)束后，用頸椎脫臼發(fā)處死小鼠。所有動物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過鄭州市中心醫(yī)院倫理委員會的同意，并嚴(yán)格按照鄭州市中心醫(yī)院（大學(xué)）實(shí)驗(yàn)動物章程進(jìn)行操作。小鼠腫瘤體積按照Peng H等的方法進(jìn)行測量和計(jì)算[15]：

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對于兩組均數(shù)的比較采用非配對t檢驗(yàn)進(jìn)行分析；對于3組及以上均數(shù)的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并以Dunnettt檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較；對于小鼠的生存率采用log-rank法進(jìn)行生存分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 EGFR靶向光敏脂質(zhì)體的表征

透射電鏡下脂質(zhì)體為均勻分布的球狀，且具有清晰的核殼結(jié)構(gòu)，見圖1。動態(tài)光散射結(jié)果顯示見表1，在經(jīng)過紫外線交聯(lián)后，脂質(zhì)體的直徑為從117.2±28.5 nm下降至82.3±10.3 nm，脂質(zhì)體溶液的多分散系數(shù)（Polydispersity index，PDI）從0.14下降至0.09，說明經(jīng)過紫外交聯(lián)后的脂質(zhì)體，具有更加緊密和均一的結(jié)構(gòu)。此外，紫外分光光度計(jì)檢測結(jié)果顯示本研究制備的溶液中DOX的終濃度為0.20 g·kg-1，而載體的濃度為0.91 g·kg-1，據(jù)此可計(jì)算出本研究制備的脂質(zhì)體藥物，其載藥量約為21.98%，包封率為40%。

圖1 透射電鏡觀察光敏脂質(zhì)體的顯微形態(tài)

表1 光敏脂質(zhì)體交聯(lián)前后粒徑變化

2.2 紫外交聯(lián)能顯著提高光敏脂質(zhì)體的穩(wěn)定性

將脂質(zhì)體在模擬人體血液環(huán)境中孵育24 h后，交聯(lián)后的脂質(zhì)體，其粒徑大小及分布的變化比未交聯(lián)的脂質(zhì)體顯著減小、穩(wěn)定性提高，見表2。

表2 紫外交聯(lián)前后光敏脂質(zhì)體的穩(wěn)定性比較

2.4 紫外交聯(lián)不會影響脂質(zhì)體內(nèi)藥物的釋放

在48 h和72 h后，交聯(lián)后的脂質(zhì)體能分別將釋放約69.5%和77.3%的DOX，而未交聯(lián)的脂質(zhì)體則分別能將約82.8%和89.7%的DOX釋放出來，見圖2?？梢?，紫外交聯(lián)可以降低脂質(zhì)體內(nèi)藥物的釋放，由于>70%的藥物在48 h后能夠成功從脂質(zhì)體中釋放出來，因此這種藥物的緩釋并不會對其負(fù)載的化療藥物的細(xì)胞毒作用造成顯著的負(fù)面影響。

圖2 紫外交聯(lián)前后，脂質(zhì)體負(fù)載DOX 的釋放情況比較

2.5 靶向光敏脂質(zhì)體能增強(qiáng)細(xì)胞對藥物的攝取

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，脂質(zhì)體藥物孵育后，N87細(xì)胞內(nèi)的紅色平均熒光強(qiáng)度較游離藥物組有顯著增強(qiáng)（P<0.05），而相比之下，PDF組N87細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度較PDB組增加更多（P<0.05），見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞對脂質(zhì)體藥物內(nèi)吞能力檢測

2.6 脂質(zhì)體能夠顯著增強(qiáng)藥物對細(xì)胞的殺傷效果

在各個(gè)治療濃度下，PDF治療組N87細(xì)胞的細(xì)胞活力較游離DOX治療組及PDB治療組顯著下降，PDF對N87細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（Half inhibitory concentration，IC50）較PDB及游離DOX有顯著降低（P<0.05），見圖4。

圖4 游離DOX 及脂質(zhì)體藥物對N87 細(xì)胞體外殺傷能力比較

2.7 靶向光敏脂質(zhì)體能夠顯著抑制荷瘤小鼠皮下腫瘤生長

與PBS對照組相比，游離DOX治療組能夠輕度一直荷瘤小鼠的皮下腫瘤生長，PDB能顯著抑制荷瘤小鼠的皮下腫瘤生長，而相比之下，PDF對小鼠皮下腫瘤的抑制能力較PDB和游離DOX更強(qiáng)（P<0.05），見圖5。

圖5 靶向脂質(zhì)體能夠顯著抑制荷瘤小鼠的皮下腫瘤生長

3 討論

化療是臨床上惡性腫瘤治療的主要手段之一，其在惡性腫瘤的術(shù)前新輔助化療、術(shù)后輔助化療以及晚期的姑息治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。然而，化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對正常組織和細(xì)胞有很強(qiáng)的毒副作用，這大大限制了其臨床應(yīng)用[16,17]。近年來，納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展，為解決化療藥物的高毒性問題提供了新的有效方法。研究表明，正常組織內(nèi)，血管內(nèi)皮細(xì)胞的間隙一般＜7 nm，而腫瘤組織內(nèi)由于血管異型增生，其內(nèi)皮細(xì)胞間隙增大，約為200-700 nm。因此，粒徑在數(shù)十到數(shù)百納米之間的納米藥物可以通過腫瘤組織的內(nèi)皮細(xì)胞間隙，但卻不能通過正常組織的內(nèi)皮細(xì)胞間隙，使得其能夠在腫瘤組織內(nèi)部特異性富集，這種效應(yīng)被稱之為增強(qiáng)的滲透與滯留效應(yīng)[18]。納米藥物的這種效應(yīng)，使得其在腫瘤治療領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用。

研究表明，納米藥物的穩(wěn)定性是影響其療效的主要因素之一[9,12]。為了增強(qiáng)納米載藥體系的穩(wěn)定性，本研究利用PC成功制備出一種對紫外線敏感的脂質(zhì)體。PC是一種二炔磷脂，其分子中的兩個(gè)炔基在紫外線照射后可以在兩個(gè)分子之間形成共價(jià)鍵連接，這使得脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層之間的連接更加緊密，這種緊密的連接大大增強(qiáng)了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性[9,12]。本研究的研究結(jié)果顯示，經(jīng)過交聯(lián)后的脂質(zhì)體，在體外模擬血液環(huán)境中的穩(wěn)定性較未交聯(lián)的脂質(zhì)體有顯著的提升。

為增強(qiáng)脂質(zhì)體的靶向性，本研究用靶向EGFR抗體Certuximab的Fab’片段對脂質(zhì)體的表面進(jìn)行了的修飾。結(jié)果表明，與游離藥物相比，脂質(zhì)體藥物能顯著提高腫瘤細(xì)胞對藥物的攝取，增強(qiáng)負(fù)載化療藥物對胃癌細(xì)胞的毒性，而Fab’片段的靶向修飾則進(jìn)一步提高了腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度和毒性。體外實(shí)驗(yàn)中我們得到了與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。靶向脂質(zhì)體的這種較強(qiáng)的體內(nèi)外腫瘤殺傷效應(yīng)主要是由于下原因：（1）脂質(zhì)體藥物的穩(wěn)定的球狀結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的攝??；（2）納米藥物通過高滲透長滯留效應(yīng)，增強(qiáng)了在腫瘤組織內(nèi)部的富集；（3）抗體Fab’片段的表面修飾，使脂質(zhì)體藥物通過抗原-抗體的識別和結(jié)合，進(jìn)一步增強(qiáng)了其在腫瘤組織內(nèi)部的富集以及腫瘤細(xì)胞對脂質(zhì)體藥物的攝取。

綜上所述，本研究制備的靶向EGFR的光敏脂質(zhì)體，擁有很好的穩(wěn)定性，在體內(nèi)、外研究中顯示出很強(qiáng)的非霍奇金淋巴瘤殺傷效果，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。