林 琳，孫 霄，齊 欣，王偉霞，侯 虎，2*

（1 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島266003 2 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 山東青島266237）

海參（Stichopus japonicus）是天然營(yíng)養(yǎng)的寶庫(kù)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，其屬于棘皮動(dòng)物門(mén)，是一種重要的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物[1]。據(jù)報(bào)道，全世界已知的海參品種約1 100 多種，其中可食性的至少有40 種[2]。仿刺參在中國(guó)北方有較大范圍的養(yǎng)殖，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，2016年產(chǎn)量達(dá)20.43 萬(wàn)t，產(chǎn)值約600 億元[3]。

新鮮海參具有易自溶、易腐敗、易變質(zhì)特點(diǎn)，給其加工、貯藏和運(yùn)輸過(guò)程帶來(lái)了很大困難[4]。傳統(tǒng)海參加工以干制海參為主，加工過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失嚴(yán)重，并且泡發(fā)過(guò)程繁瑣。即食海參具有方便快捷、綠色營(yíng)養(yǎng)的顯著優(yōu)勢(shì)。即食海參加工過(guò)程中，高溫高壓處理能滅活微生物和內(nèi)源酶，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和活性成分流失較少[5]。然而，在貯藏過(guò)程中，高溫高壓海參（HSC）體壁易出現(xiàn)非酶非微生物的自溶現(xiàn)象，其體壁軟化變黏，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的質(zhì)量和貨架期[6]。貯藏過(guò)程中HSC 體壁質(zhì)構(gòu)的變化與微觀結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān)，目前關(guān)于微觀結(jié)構(gòu)的研究很少。徐志斌等[7]研究發(fā)現(xiàn)水發(fā)海參的微觀結(jié)構(gòu)之間存在明顯差異。Zhang 等[8]研究發(fā)現(xiàn)低含水量刺參體壁的貯藏穩(wěn)定性顯著性提高，然而微觀結(jié)構(gòu)的變化卻不清楚。

本文在已有研究的基礎(chǔ)上，在微尺度下探討貯藏過(guò)程中不同濕含量的HSC 組織結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。通過(guò)制備不同濕含量的HSC，研究其在貯藏過(guò)程中TPA 參數(shù)、水分狀態(tài)等的變化，探討膠原纖維束和膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)的差異，為干預(yù)HSC組織結(jié)構(gòu)的劣化，延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 鮮活仿刺參，規(guī)格（100±10）g，購(gòu)于青島市南山水產(chǎn)品市場(chǎng)。

1.1.2 試劑 平板計(jì)數(shù)瓊脂，青島海博生物技術(shù)有限公司；NaCl、戊二醛、無(wú)水乙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

掃描電子顯微鏡（JSM-840），日本JEOL 公司；透射電子顯微鏡（JEM-2000EX），日本JEOL公司；質(zhì)構(gòu)儀（TMS-PRO），美國(guó)FTC 公司；智能水分活度測(cè)量?jī)x（HD-3A），無(wú)錫市華科儀器儀表有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS），上海申安醫(yī)療器械廠；人工氣候箱（HPG-320H），哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；臺(tái)式真空干燥箱（DZF-6050），上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理 選擇質(zhì)量相近、大小均勻的鮮活刺參，在尾部開(kāi)口2～3 cm，去除內(nèi)臟，用蒸餾水沖洗干凈，于60 ℃水浴加熱3 min（m刺參∶m水=1∶20），然后100 ℃加熱10 min（m刺參∶m水=1∶20）。將處理后的刺參去頭、尾，用刀片進(jìn)行“十字”4 等分。將刺參置于真空干燥箱中，于60 ℃分別干燥0，4，6，8，11，14 h，依次標(biāo)記為A，B，C，D，E，F(xiàn) 組。用高溫蒸煮袋單獨(dú)包裝，置高壓滅菌鍋中121 ℃（0.2 MPa）處理15 min。高溫高壓處理完成后，于37 ℃貯藏30 d，期間取樣分析。

1.3.2 菌落總數(shù)的測(cè)定 HSC 中菌落總數(shù)的測(cè)定依照GB4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》。

1.3.3 TPA 參數(shù)的測(cè)定 利用TMS-PRO 質(zhì)構(gòu)儀分析樣品的硬度、彈性、黏聚性、咀嚼性、恢復(fù)性。樣品測(cè)定時(shí)采用直徑4 mm 圓柱型探頭，下壓速度50 mm/min，樣品形變量70%，循環(huán)操作兩次[9-10]。

1.3.4 水分含量的測(cè)定 HSC 中水分含量的測(cè)定依照恒溫干燥法（GB5009.3-2010）[11]。

1.3.5 水分活度的測(cè)定 水分活度的測(cè)定使用HD-3A 智能水分活度測(cè)量?jī)x。用剪刀將樣品剪碎處理后置于儀器中測(cè)定，樣品測(cè)定前用過(guò)夜放置的飽和NaCl 溶液進(jìn)行儀器校正，室溫下每個(gè)HSC樣品的測(cè)量時(shí)間為15 min[12]。

1.3.6 SEM 圖像的測(cè)定 將HSC 樣品用刀片切成1 cm3的方形小塊，浸泡在2.5%戊二醛溶液中，于4 ℃固定[13]。用梯度乙醇脫水后，使用臨界點(diǎn)干燥法干燥，離子濺射噴金后掃描電子顯微鏡下觀察和拍照。

1.3.7 TEM 圖像的測(cè)定 HSC 樣品處理及固定方式如1.3.6 節(jié)所示。包埋后用LKB 超顯微儀切片（70 nm），醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色后在透射電子顯微鏡下觀察和拍照[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0 軟件處理數(shù)據(jù)；采用Origin 8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏過(guò)程中菌落總數(shù)的變化

由表1 可知，在0～30 d 貯藏期間，不同濕含量HSC 組織中的菌落總數(shù)始終為0，表明HSC 在37 ℃貯藏過(guò)程中的結(jié)構(gòu)變化不是由微生物和酶引起的。趙園園等[15]研究發(fā)現(xiàn)在類(lèi)似的滅菌條件處理，仿刺參樣品的菌落總數(shù)為0。在此基礎(chǔ)上，本文分析非酶、非微生物條件下，HSC 體壁微觀結(jié)構(gòu)的變化。

表1 濕含量差異的刺參組織在37 ℃貯藏過(guò)程中菌落總數(shù)的變化Table 1 Changes of total number of colonies of HSC with different humidity ratio at 37 ℃

2.2 貯藏過(guò)程中TPA 參數(shù)的變化

由圖1a 和1b 可知，貯藏0 d 時(shí)，HSC 體壁的硬度和咀嚼性均隨濕含量的減小而明顯增大，原因可能是濕含量低的膠原纖維束形成逐漸致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[16]。Zhang 等[8]研究了刺參組織在熱處理8 h 過(guò)程中硬度和咀嚼性的變化情況，得出與本文類(lèi)似的結(jié)論。

在37 ℃貯藏30 d 時(shí)，A～F 組的硬度和咀嚼性均呈逐漸減小的趨勢(shì)，原因是HSC 的結(jié)構(gòu)逐漸被破壞和降解[17]，表明濕含量差異不能改變HSC 體壁組織劣化的趨勢(shì)。一階動(dòng)力學(xué)方程：y=aebx已在組織劣化的動(dòng)力學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用[18-19]。本文在對(duì)37 ℃貯藏過(guò)程中不同濕含量HSC 的硬度和咀嚼性進(jìn)行方程擬合時(shí)同樣用此劣化模型[4]，擬合結(jié)果見(jiàn)表2所示。通過(guò)計(jì)算半數(shù)衰減周期（T50），發(fā)現(xiàn)濕含量與硬度和咀嚼性的穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)。這表明濕含量是影響HSC 樣品硬度和咀嚼性的重要因素，且濕含量與硬度和咀嚼性下降的速率呈正相關(guān)。

由圖1c 和1d 可知，當(dāng)濕含量大于75%時(shí)（A和B 組），彈性和黏聚性呈明顯的下降趨勢(shì)。當(dāng)濕含量小于75%時(shí)（C～F 組），彈性和黏聚性呈規(guī)律性的變化。Zhang 等[8]研究了濕含量84.92%～62.49%的HSC 組織在37 ℃貯藏過(guò)程中彈性和黏聚性的變化規(guī)律，得出與本文類(lèi)似的結(jié)論。

以上結(jié)果表明濕含量對(duì)HSC 質(zhì)構(gòu)特性的影響非常關(guān)鍵。為延長(zhǎng)HSC 產(chǎn)品的貨架期可采用減小濕含量的手段來(lái)顯著性地減緩硬度與咀嚼性的下降速率。

圖1 濕含量差異的刺參組織37 ℃貯藏過(guò)程中TPA 參數(shù)的變化Fig.1 Changes of TPA parameters of HSC body wall with different humidity ratio at 37 ℃

表2 濕含量差異的刺參組織37 ℃貯藏過(guò)程中硬度和咀嚼性的擬合結(jié)果Table 2 The fitting results of the hardness and chewiness value of HSC with different humidity ratio at 37 ℃

2.3 貯藏過(guò)程中水分含量和水分活度的變化

由圖2a 可知，成功制備了不同濕含量的HSC樣品。當(dāng)HSC 在真空條件下60 ℃干燥0～14 h，濕含量從78.64%減至50.48%。這可能是由于膠原纖維束發(fā)生熱收縮，HSC 組織中的大量水分子流失到樣品外。Zhang 等[8]將HSC 在相同條件下干燥0～8 h，制備濕含量從84.92%至62.49%的HSC 樣品。在30 d 貯藏過(guò)程中，不同濕含量HSC 組織的水分含量均呈先增大后基本不變的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榇嬖谟诟邷卣糁蟠械臉悠酚捎诟邷馗邏禾幚硎サ乃肿釉谫A藏前期被HSC 重新回吸到膠原纖維束中[20]。Peng 等[4]研究了正常濕含量的HSC 組織在37 ℃貯藏過(guò)程中水分含量的變化情況，得到與本研究近似的結(jié)果。

圖2 濕含量差異的刺參組織37 ℃貯藏過(guò)程中水分含量（a）和水分活度（b）的變化Fig.2 Changes of moisture content（a）and water activity（b）of HSC body wall with different humidity ratio at 37 ℃

水分子在HSC 樣品中的存在狀態(tài)可通過(guò)水分活度的變化來(lái)反映[21]。由圖2b 可知，貯藏0 d時(shí)，水分活度隨濕含量的減小而明顯減小，原因是膠原纖維束發(fā)生熱收縮，損失大量自由水。Zhang等[22]研究了刺參組織在熱處理過(guò)程中水分活度的變化情況，得出類(lèi)似的結(jié)論。在37 ℃貯藏30 d 過(guò)程中，濕含量差異的HSC 的水分活度均呈增大的趨勢(shì)，原因是HSC 組織不斷地從包裝袋內(nèi)吸收水分。另一方面，HSC 的組織結(jié)構(gòu)逐漸劣化，部分機(jī)械水和結(jié)合水轉(zhuǎn)化為自由水[23]。Zhang 等[8]研究了濕含量差異的HSC 組織在37 ℃貯藏過(guò)程中水分活度的變化情況，同樣發(fā)現(xiàn)水分活度呈上升的趨勢(shì)。

2.4 貯藏過(guò)程中SEM 圖像的變化情況

由圖3 可知，貯藏0 d 時(shí)，膠原纖維束的排列較為致密，且纖維束的直徑較粗。隨著濕含量的減小，膠原纖維束的直徑均明顯減小，并逐漸形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。膠原纖維束直徑的減少造成水分含量的顯著性降低，而形成的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)導(dǎo)致硬度和咀嚼性顯著性增大。

在37 ℃貯藏20 d 后，膠原纖維束發(fā)生大規(guī)模的斷裂，從SEM 圖像中觀察到明顯的孔狀結(jié)構(gòu)，這是導(dǎo)致硬度和咀嚼性顯著性減小的關(guān)鍵因素。濕含量較高的組（A 和B 組）開(kāi)始呈現(xiàn)多孔狀結(jié)構(gòu)，而較低的濕含量組（C～F 組）顯著減小貯藏過(guò)程中HSC 體壁微觀結(jié)構(gòu)的破壞程度。

以上結(jié)果表明：在37 ℃貯藏過(guò)程中膠原纖維束的結(jié)構(gòu)逐漸被破壞，其程度與HSC 樣品的濕含量呈正相關(guān)，而濕含量差異并不能改變劣化的過(guò)程。Zhang 等[8]采用VG 染色法研究了37 ℃貯藏過(guò)程中濕含量差異的HSC 組織膠原纖維束結(jié)構(gòu)的變化情況，膠原纖維束結(jié)構(gòu)在貯藏過(guò)程中逐漸被破壞，其程度與濕含量呈正相關(guān)。趙園園等[15]研究了不同處理的HSC 組織37 ℃貯藏過(guò)程中組織結(jié)構(gòu)的變化情況，也發(fā)現(xiàn)減小濕含量可以減小HSC體壁組織結(jié)構(gòu)的被破壞程度。

2.5 貯藏過(guò)程中TEM 圖像的變化

新鮮的仿刺參組織在透射電鏡下呈明、暗相間的D-周期結(jié)構(gòu)，這是膠原纖維最具代表性的特征，由膠原纖維內(nèi)膠原分子的1/4 錯(cuò)位排列而引起[24]。由圖4 可知，貯藏0 d 時(shí)，在TEM 圖像中均未觀察到標(biāo)志性的D-周期結(jié)構(gòu)，僅觀察到條帶狀結(jié)構(gòu)，表明膠原纖維束的結(jié)構(gòu)已被破壞，膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解螺旋[25]。隨著濕含量的減小，條帶狀結(jié)構(gòu)變得模糊不清，表明制備濕含量差異的HSC 組織過(guò)程中膠原纖維束的微觀結(jié)構(gòu)被破壞，其程度與熱處理強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)。

圖3 濕含量差異的刺參組織37 ℃貯藏時(shí)SEM 圖像的變化Fig.3 Changes of SEM images of HSC with different humidity ratio at 37 ℃

圖4 濕含量差異的刺參組織37 ℃貯藏時(shí)TEM 圖像的變化Fig.4 Changes of TEM images of HSC with different humidity ratio at 37 ℃

在37 ℃貯藏20 d 后，膠原纖維束的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步斷裂，膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解螺旋和降解。濕含量較高的組（A 和B 組）出現(xiàn)明顯的片段化結(jié)構(gòu)，造成HSC 組織的水分活度較高，表明水分活度值與自降解的速率呈正比；而較低的濕含量組（C～F 組）可較好地維持條帶狀結(jié)構(gòu)，說(shuō)明降低濕含量可極大地減少HSC 體壁結(jié)構(gòu)被破壞的程度。

以上結(jié)果表明在37 ℃貯藏過(guò)程中HSC 組織的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的劣化，劣化速率與濕含量呈正相關(guān)，而濕含量差異不能改變劣化的過(guò)程。其原因可能是：水分子可作為質(zhì)子傳遞的介質(zhì)，對(duì)分子間肽鍵及其它化學(xué)鍵的轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵性的作用[26]。濕含量較高組的質(zhì)子傳遞速率較快，組織結(jié)構(gòu)被破壞的程度較大；而較低濕含量組顯著抑制了質(zhì)子傳遞的速率。

3 結(jié)論

濕含量差異的HSC 組織在37 ℃貯藏過(guò)程中，發(fā)生非酶、非微生物因素引起的劣化現(xiàn)象。微觀結(jié)構(gòu)的破壞程度與濕含量呈顯著正相關(guān)，可通過(guò)減少濕含量而降低HSC 體壁結(jié)構(gòu)的破壞程度，從而延長(zhǎng)HSC 產(chǎn)品的貨架期。