徐偉麗，穆 韡，魯兆新，徐貴華

（1 哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程系 哈爾濱150001 2 哈爾濱工業(yè)大學生物分子與化學工程系 哈爾濱150001 3 河南科技學院食品學院 河南新鄉(xiāng)453003）

花色苷（anthocyanins，ACNs）是類黃酮水溶性色素，廣泛存在于花卉、水果、蔬菜、谷物和草藥中[1]。自然界中的ACNs 主要是黃酮基（2-苯基-苯并吡嗪鹽）的多羥基和多甲氧基糖苷衍生物[2]。流行病學研究表明，ACNs 的攝入可以改善許多慢性疾病，如心血管疾病、糖尿病、關節(jié)炎和癌癥[3]。富含ACNs 的植物提取物，如漿果果渣提取物比單一酚類化合物具有更強的抗氧化作用[4]，但它們是不穩(wěn)定的化合物，在高pH 值、氧氣、光、熱和特定酶的存在下容易降解[5]，很難到達腸道，口服后生物利用度低。保護ACNs 的生物活性以增強其穩(wěn)定性并促進其在目標吸收位點的釋放，是一項技術挑戰(zhàn)。

研究證明W1/O/W2型復乳可以有效防止食品體系中各種成分的相互作用，是實現親水性生物活性物質保護和靶向輸送的最佳微囊化技術[6-8]。最近，體外模型作為了解微膠囊的基本物理化學性質和被包埋組分控釋的工具而備受關注[9]。消化時，內水相、油相和外水相的物理性質都對微膠囊的包埋率，生物活性成分的穩(wěn)定性及其控釋性質起重要作用[10]。雖然此前報道了一些關于單層或雙層微膠囊的消化研究[11]，但是就復乳在胃、腸道消化時微觀結構的變化及其內水相或內部W1/O單一乳液的靶向輸送情況尚未闡明。

此前關于包埋ACNs 的研究主要使用多糖作為外水相[12]，而對于使用WPI 溶液作為乳化劑包埋ACNs，以及通過口腔和胃、腸道連續(xù)消化負載ACNs 的W/O/W 型復乳的信息有限。本研究的目的是評價以葡萄皮粉ACNs 提取液為內水相（W1），含聚甘油聚蓖麻油酸酯（PGPR）的玉米油為油相，WPI 溶液為外水相（W2）的W/O/W 型復乳，表征其在體外消化過程中的微觀結構、流變學特性、靶向傳輸和抗氧化活性的變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄皮粉，加拿大約瑟夫天然產物公司；WPI（97.5%蛋白質），美國戴維斯科食品國際公司；玉米油，市購；ACN 標準品，美國Indofine 化學公司；HCl、檸檬酸和苯甲酸鈉，美國Sigma 公司；聚甘油聚蓖麻油酸酯（PGPR，4175），美國Palsgaard 公司；6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-羧酸（Trolox）、2，2'-偶氮二-（2-甲基丙脒）二鹽酸鹽（AAPH）、2，2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）、L-抗壞血酸、熒光素和苯甲基磺酰氟（PMSF），Sigma-Aldrich 化學公司；氯化鈉和HPLC 級溶劑，加拿大卡利登實驗室。

1.2 儀器與設備

勻漿器（PT 2500 E），瑞士Kinematica AG 公司；微流化器，加拿大ATS 公司；光學顯微鏡、照相機（AxioCam MRC5），德國Zeiss 公司；粒度電位儀（Zetasizer），英國Malvern 儀器公司；流變儀（ARES-LS1），美國TA 儀器公司；UV 微板讀數器，美國Bio-Tek 儀器公司；離心過濾裝置（30，000-MWCO Amicon-Ultra 15），德國Millipore 公司；光電二極管陣列檢測器，德國安捷倫科技公司；C18分析柱（150 mm×4.6 mm i.d.×5 μL），中國北京迪科馬科技公司。

1.3 方法

1.3.1 制備WPI 溶液和葡萄皮提取物 將WPI粉末溶于去離子水（2.5%，質量分數）中，磁力攪拌2 h，4 ℃過夜和儲存。將20 g 葡萄皮粉在600 mL 50%（體積分數）甲醇中50 ℃超聲提取1 h，用濾紙（Whatman Grade No.1）過濾。如此進行兩次，合并濾液，使用旋轉蒸發(fā)儀在40 ℃條件下對其濃縮。將最終提取物（不含甲醇）置-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 復乳的制備 參考文獻[13]制備W1/O/W2型復乳。

1.3.3 模擬體外消化 根據先前報道[11]的方法進行體外模擬消化。將沒有添加樣品的空白作對照，在相同條件下處理以校正來自消化酶和緩沖液的干擾。該體外消化模擬系統(tǒng)用于模擬人類口腔、胃和小腸的消化過程。

1.3.4 顯微鏡觀察 拍攝照片，評估乳液表面形態(tài)的變化。將光學顯微鏡與AxioCam MRC5 照相機連接，觀察乳液的微觀結構（100×）。

1.3.5 粒徑和ζ-電勢測定 參考文獻[13]進行檢測。

1.3.6 流變學性質測定 用ARES-LS1 流變儀測定乳液的流變學性質。測量期間乳液的溫度保持在25 ℃。

1.3.7 HPLC 法測定ACNs 將60 μL 葡萄皮提取物（相當于1 mL W/O/W 乳液中的量）稀釋至5 mL（3.3 mL 5 mol/L HCl 和1.7 mL Milli-Q 水）。此溶液在100 ℃溫度下保持60 min，以確保將ACNs 完全水解成花青素。冷卻后，用0.45 μm 過濾器過濾。25 ℃條件下使用配備光電二極管陣列檢測器（PAD）和C18分析柱的Agilent 1100 系統(tǒng)進行HPLC 分析。使用體積分數10%甲酸（溶液A）和100%甲醇（溶液B）梯度洗脫，即：0～20 min，95%A/ 5%B 至40%A/60%B 的線性梯度洗脫；20～23 min，40%A/60%B 的等度洗脫；23～24 min，40%A/ 60%B 到95%A / 5%B 的線性梯度洗脫；24～28 min，95%A/5%B 的等度洗脫。洗脫液流速0.8 mL/min，注射樣品體積100 μL。在波長520 nm 處定量外標（即氯化翠雀寧、氯化矢車菊素、氯化天竺葵素和氯化錦葵色素），并基于峰面積建立校準曲線。

1.3.8 W1/O/W2型復乳中ACNs 的釋放檢測 采用文獻[13]中的HPLC 法測定W/O/W 復乳中ACNs 的釋放率。計算ACNs 的包埋率（EE，%）公式：

式中，G1——乳液中游離ACNs 的含量（μg/mL）；G0——制備時加入的ACNs 總量（μg/mL）。

ACNs 的釋放率（R）計算公式：

1.3.9 W1/O/W2型復乳抗氧化活性評價 按照Li等[14]的方法測定樣品的抗自由基活性（DPPH 測定法）。提取物的氧自由基吸收能力（ORAC）測定采用文獻[11]的方法，通過標準曲線將結果表示為μmol/Trolox 物質的量。根據文獻[10]方法測定鐵還原能力（FRAP），抗氧化活性表示為μmol/L 抗壞血酸物質的量。

1.3.10 乳液穩(wěn)定性測量 將不同消化階段收集的乳液轉移到無菌離心管中，用塑料蓋密封，25℃下儲存24 h。數碼相機拍攝乳液照片。

1.3.11 統(tǒng)計分析 文中使用SPSS 14.0 軟件統(tǒng)計分析，結果表示為3 次獨立試驗結果的平均值（±s）。采用單因素方差分析（ANOVA）進行組間比較。

2 結果與分析

2.1 W1/O/W2 型復乳的形態(tài)和儲存穩(wěn)定性

本研究使用PGPR 和WPI 作為乳化劑，制備包埋ACNs 提取物的W/O/W 型復乳（6%，質量分數），乳液的形態(tài)和微觀結構如圖1～4所示。結果表明，制備的所有乳液都質地均勻且表面光滑（圖1A），W1/O/W2和O/W2乳液為白色并具有良好的流動性，W1/O 乳液呈淺粉色，有黏性。W1/O/W2和O/W2乳液的平均粒徑分別為（287.90±3.12）nm（PDI=0.193±0.022）和（299.70±5.83）nm（PDI=0.146±0.023）。顯微鏡分析顯示，小油滴均勻分布在O/W2乳液的水相中（圖2B），水滴均勻分布在W1/O 乳液的油相中（圖2C）。此外，根據Florence等[15]分類，許多W1/O 小液滴存在于外水相內部（圖2A），表明其為B 型W1/O/W2復乳。

圖1 乳液照片Fig.1 Photographs of different emulsions

乳液的穩(wěn)定性在食品加工和儲存過程中非常重要。4 ℃儲存5 周的樣品依舊均勻，無游離油滴，液滴未發(fā)生團聚現象（圖1A）。結果表明，4 ℃儲存35 d 的復乳表現出良好的穩(wěn)定性。然而，W1/O/W2型復乳在胃中消化30 min 發(fā)生相分離現象，表明胃消化會破壞乳液的穩(wěn)定性（圖1B）。

2.2 體外模擬消化對W1/O/W2 型復乳微觀結構的影響

使用顯微鏡（圖2）和激光衍射（圖3 和圖4）評估體外不同消化階段的W1/O/W2型復乳的微觀結構。初始復乳乳滴的平均粒徑為（287.90±3.12 nm）（PDI=0.193±0.022）（圖3），整體粒徑分布在50～1 000 nm 范圍（圖4）。經口腔消化后，液滴粒徑和形態(tài)未發(fā)生明顯改變 【d =（296.13 ± 2.52）nm】（圖3，圖2A，2D）。當乳液經口腔移動到胃部消化后，液滴仍保留雙層結構，但粒徑顯著增加【d=（619.40±15.96）nm】（圖2E，圖3 和圖4）。其原因是蛋白質水解導致復乳的表面結構改變，小液滴融合成具有雙層結構的不穩(wěn)定的較大液滴。這也可能是圖1B所示相分離的原因。相反，Shima等[16]研究顯示雙層復乳在模擬胃部消化期間是穩(wěn)定的。而Xiao 等[17]發(fā)現大多數復乳液滴在胃消化過程中塌陷并釋放出內水相。上述研究結果的不一致可能與模擬胃液化學組分和pH 值不同以及外水相有關。

顯微照片證實，模擬腸道消化后乳滴完全失去雙層結構并變?yōu)榭沼偷危▓D2F）。這表明雙層結構的外部蛋白被完全消化，酶解使W1/O 液滴破裂并釋放ACNs，油相被膽汁鹽乳化后聚集并重新形成油滴，因此未觀察到相分離現象（圖1B）。Andrade 等[18]和Frank 等[19]的研究結果與本研究結果一致，也證實在體外消化過程中使用含脂肪酶和膽汁的人工消化液，W/O/W 型復乳發(fā)生油相的水解和聚結。

2.3 體外模擬消化對乳液ζ-電位的影響

監(jiān)測體外不同消化階段乳液液滴所帶電荷情況，即ζ-電位。WPI 穩(wěn)定的初始乳液（pH 6.6～6.8）具有負ζ-電位（約-45 mV）（圖5），這主要取決于乳化劑WPI 的性質。模擬口腔消化（pH 6.8～7.0）后，乳液液滴帶有相對較少的負電荷（約-39 mV）。當乳液經口轉移到胃消化后，乳液電勢為正【（12.80±0.28）mV】（pH=2.0）。乳液液滴電荷的變化與多種因素有關，例如：溶液pH 值和離子強度的變化，或者帶電物質從胃液吸附到乳化劑涂層上。模擬胃液消化后，如果界面組成沒有變化，pH 值低于等電點（PI），WPI 包被的微粒就會攜帶正電荷[20]。WPI 含有球狀蛋白質，如β-乳球蛋白，可以形成共價交聯的界面。在模擬胃消化過程中，β-乳球蛋白對酸和酶的降解具有抗性[21]。這可以解釋大量乳滴在模擬胃環(huán)境中保留蛋白層的現象。乳液經胃轉移到模擬小腸（pH 6.8）消化后的ζ-電位值（-63.97±3.04）mV 甚至高于初始乳液。pH 值的影響是乳液微粒攜帶較多負電荷的主要原因。其它研究[22]也報道了在體外消化模型中β-乳球蛋白包被的液滴ζ-電位的類似結果。

圖2 不同乳液的顯微照片Fig.2 Photomicrographs of different emulsions

圖3 不同體外消化階段W1/O/W2 型復乳液滴的平均粒徑Fig.3 Mean particle diameters of W1/O/W2 emulsion after in vitro digestion

圖4 W1/O/W2 型復乳的粒徑分布Fig.4 Particle size distributions of W1/O/W2 emulsions

圖5 W1/O/W2 乳液的ζ-電位Fig.5 ζ-potential of W1/O/W2 emulsions

2.4 體外模擬消化對乳液流變學性質的影響

流變特性與食品配方、加工條件以及食品口感等感官特性高度相關[23]，這使其在食品應用方面非常重要。在給定質量濃度的乳液中，乳液黏度取決于液滴相互作用的性質和聚集程度[24]。本研究使用流變儀追蹤體外不同消化階段乳液的黏度變化（圖6）。隨著剪切速率的增加，W1/O/W2復乳和O/W2乳液的黏度未發(fā)生明顯變化，表明這些乳液屬于牛頓流體。這與Wang 等[25]的研究結果一致。然而，另有報道顯示，復乳是非牛頓流體，其復雜的流變行為，使在高剪切力下變稀的程度更大[26]。最近的一項研究表明當剪切速率在1～100 s-1時，O/W 乳液表現出典型的假塑性流體特性[27]。這些不同的結果可能是由所用乳化劑的類型和濃度，以及分散相的體積不同所致。隨著剪切速率的增加，W/O 乳液的黏度緩慢下降，表明這些乳液是非牛頓流體[28]。Jiao 等[29]也得出相同的結論。然而，Abivin 等[30]發(fā)現W/O 乳液的黏度與剪切速率曲線表現出牛頓流體特性。W1/O/W2和O/W2乳液與水的黏度相近（＜0.1），W1/O 乳液的黏度高于這兩種乳液（W1/O/W2和O/W2）。體外消化后，W1/O/W2乳液發(fā)生剪切變稀，可能是由乳液液滴變形和/或結構破壞導致的[31]。

2.5 體外模擬消化對W1/O/W2 乳液中ACNs 釋放的影響

研究了體外消化對W1/O/W2乳液中包埋的ACNs 釋放的影響，結果如圖7所示。初始W1/O/W2復乳ACNs 的包埋率為（93.19±2.78）%。在口腔消化后，ACNs 仍保持在乳液的內水相中。經胃消化后，復乳的內水相中ACNs 少量被釋放，這是因為乳液微粒仍具有雙層結構，ACNs 主要存在于微粒的內部水相（圖2E）。Frank 等[19]、Oidtmann 等[32]和Flores 等[11]也有類似的發(fā)現。然而，Xiao 等[17]和Andrade 等[18]證明，在胃消化階段由于液滴結構的破壞，W/O/W 復乳的內水相（W1）大部分釋放。而Shima 等[16]的研究表明復乳不受人工無酶胃液的影響，包埋率沒有變化。

ACNs 主要在模擬腸道消化過程中釋放，釋放率為（41.89±2.95）%。其主要原因可能是胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化，復乳成為單一的W1/O 乳液，而W1/O 液滴的油層進一步被酶水解，ACNs 被釋放。相反，Aditya 等[33]報道在體外無酶腸道消化1 h，超過45%的姜黃素從W/O/W 復乳中釋放出來。這種差異可能與人工消化液的化學成分、包埋方法、壁材類型或內層水相的物理化學性質有關[18]。

圖6 乳液的黏度-剪切速率曲線圖Fig.6 Viscosity-rate of shear curves for emulsions

2.6 體外模擬消化過程中W1/O/W2 復乳抗氧化活性的變化

圖7 ACNs 在W1/O/W2 復乳中的包埋率Fig.7 The encapsulation efficiency of ACNs in W1/O/W2 emulsions

包埋ACNs 的復乳在體外不同消化階段的抗氧化活性如圖8所示。在體外消化過程中乳液的FRAP 值沒有明顯的變化。然而，DPPH 和ORAC值隨著體外消化的進行呈顯著增加趨勢（P＜0.05）。在模擬腸道消化后，從乳液檢測出最高的抗氧化活性，其原因主要是微膠囊中ACNs 的大量釋放。Ydjedd 等[34]研究表明：在腸道消化過程中最高劑量的酚類物質和類黃酮物質從微膠囊中釋放出來。這一結果與本研究發(fā)現一致。經胃消化后，仍有（82.13±1.90）%的ACNs 包埋在油相中。然而，與初始復乳和經口腔消化后的復乳（階段I）相比，經胃消化后的復乳具有更高的抗氧化活性（P＜0.05）。這可歸因于胃消化過程中W1/O/W2液滴的雙層結構被破壞且ACNs 在親水介質中易于擴散[33]。WPI 被消化酶水解產生的抗氧化肽，可能也是這種高抗氧化活性的部分原因[35]。本研究結果表明，在整個模擬胃、腸消化過程中W1/O/W2復乳能夠穩(wěn)定ACNs 的高抗氧化活性。然而，Cofrades等[36]報道了相反的結果，由于體外模擬胃部和腸道消化使生物活性化合物損失，因此使復乳和凝膠化復乳的抗氧化活性顯著降低。

圖8 W1/O/W2 乳液的抗氧化活性Fig.8 Antioxidant activity of W1/O/W2 emulsions

3 結論

本研究結果表明，負載ACNs 的W1/O/W2復乳具有較高的包埋率【（93.19±2.78）%】和較好的儲存穩(wěn)定性?？谇幌髲腿榈囊旱挝窗l(fā)生明顯的形態(tài)變化。經模擬胃液消化后，大量液滴相互融合形成不穩(wěn)定的較大顆粒，然而仍具有雙層結構。在腸道消化過程中，液滴釋放出內部水相而變成油滴。黏度分析結果也表明，體外消化使復乳液滴的結構受損。此外，ACNs 釋放率和抗氧化活性分析證實包埋的ACNs 可針對性地運送至模擬小腸中。這些結果表明，W1/O/W2復乳是潛在的，可用于穩(wěn)定水溶性生物活性成分并控制其在腸道中靶向釋放的微載體系統(tǒng)。