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        山西老陳醋源植物乳桿菌C181對小鼠酒精肝損傷的保護作用

        2021-03-06 07:36:22孫建平陳旭峰王佳麗賈瑞娟王如福
        中國食品學報 2021年2期
        關鍵詞:小鼠植物

        許 女,孫建平,陳旭峰,王佳麗,賈瑞娟,張 浩,王如福

        (山西農業(yè)大學食品科學與工程學院 山西太谷030801)

        近年的肝病統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明,酒精性肝病己成為僅次于病毒性肝炎病癥的第二大肝臟疾病。長期且大量飲酒會使線粒體及微管受到損傷,從而導致脂肪酸及乙醇的氧化過程受到阻礙,最終脂肪酸和乙醇大量堆積在肝臟細胞中,使肝臟細胞損傷嚴重。乙醇氧化成乙醛,乙醛具有較高的毒性和反應活性,在酒精性肝損傷中起到關鍵作用。除此之外,酒精性肝病發(fā)生之后,肝臟細胞合成與釋放大量炎癥因子能破壞腸黏膜細胞的緊密連接,增加腸道通透性,造成腸道損傷,腸道菌群異常(比如革蘭氏陰性菌增多),產生的內毒素等有毒物質誘導炎癥反應,進一步加重肝臟及其他器官的損傷。

        許多功能性食品有助于降低疾病風險,提高代謝性和變性疾病患者的健康質量。其中一種具有代表性的功能性食品是益生菌。乳酸菌是一種益生菌,可抑制革蘭氏陰性菌在腸道生長,維持腸道菌群平衡,保護腸道細胞,阻斷內毒素由腸道轉向肝臟。國內外許多學者把對益生菌的研究作為預防及治療酒精性肝病的新方向。雙歧桿菌被發(fā)現(xiàn)能夠抑制腸道微生物群中病原體的生長,增加宿主的免疫系統(tǒng),并具有抗肥胖、抗結腸炎和保護肝臟的作用。Zhao 等[1]報道,鼠李糖乳桿菌通過增強HIF 介導的信號轉導,改善腸道上皮細胞的完整性和通透性,酒精肝的預防和治療可以通過上調miR122a 以及抑制肝細胞的凋亡等來實現(xiàn)。發(fā)酵乳桿菌則通過清除活性氧(ROS),調節(jié)一氧化氮合酶(iNOS)和熱激蛋白的表達來改善乙醇誘導的肝損傷[2]。Tian 等[3]也同樣證實鼠李糖乳桿菌CCFM1107 主要是清除體內自由基,降低氧化壓力,恢復平衡腸道菌群,以達到預防治療酒精肝損傷的目的。另外,Chiu 等[4]做體外細胞試驗,結果發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌MYL01 可以調節(jié)肝臟細胞的促炎因子(如:腫瘤壞死因子-TNF 和抗炎因子IL-10)的表達,減輕酒精誘導的肝細胞受損。Segawa 等[5]通過研究短乳桿菌SBC8803 的保肝、護肝作用也證實了此結論。其它益生菌(包括嗜酸乳桿菌等)在暴露于氧化應激的小鼠體內顯示出對肝臟的保護作用[6]。這些結果表明,益生菌通過調節(jié)促炎細胞因子和胃、腸通透性來減輕肝臟損傷和胃炎。到目前為止,有關益生乳酸菌對酒精肝損傷的確切預防機制仍不清楚。

        本文研究一株分離于山西老陳醋醋醅中的植物乳桿菌C181 對酒精肝損傷的保護作用,為其進一步開發(fā)應用奠定了研究基礎。

        1 材料與方法

        1.1 主要材料與試劑

        植物乳桿菌C181(Lactobacillus plantarum C181),山西農業(yè)大學食品科學與工程學院生物工程實驗室;超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)測定試劑盒,南京建成生物工程研究所;白介素IL-6、腫瘤壞死因子TNF-α、干擾素IFN-γ 測定試劑盒,武漢貝茵萊生物科技有限公司;游離脂肪酸測定試劑盒、總RNA 提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司;TaKaRa RR036A 反轉錄試劑盒、TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM II,寶生物工程(大連)有限公司。

        1.2 主要儀器、設備

        CFX96 熒光定量PCR 儀,美國BioRad 公司;SpectraMax i3x 酶標儀,美國Molecular Devices 公司;高速冷凍離心機,美國Sigam 公司。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 酒精誘導肝損傷小鼠實驗

        1)受試菌液的制備 將試驗菌株按3%接種量接于MRS 液體培養(yǎng)基,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h,8 000 r/min 離心10 min,棄上清液,加無菌生理鹽水洗滌菌體細胞2 次,調OD 值使菌液濃度分別達1010,108CFU/mL 和106CFU/mL。

        2)酒精誘導肝損傷小鼠實驗 50 只健康的昆明小鼠被適應性喂養(yǎng)1 周,將其隨機分為空白對照組、酒精肝損傷模型組、植物乳桿菌C181 低、中、高劑量組,每組10 只。植物乳桿菌低、中、高劑量組每天分別灌胃濃度為106,108CFU/mL 和1010CFU/mL 受試菌液1 mL,酒精肝模型組和對照組的小鼠用生理鹽水代替菌液,4 h 后空白對照組小鼠灌胃1 mL 純凈水,其它各組小鼠灌胃1 mL 52°紅星二鍋頭白酒。自由攝取食物和水,動物房的溫度(22±2)℃,濕度(56±5)%,飼養(yǎng)4 周。各組小鼠在實驗最后一天禁食12 h,稱重,摘眼球取血,將血樣3 500 r/min 離心10 min,分離制備血清。小鼠脫臼死后,取其肝臟,稱重,于-80 ℃超低溫冰箱保存,備用。

        1.3.2 指標測定

        1)血清ALT、AST 活性和肝臟氧化應激指標的測定 按試劑盒說明書測定小鼠血清ALT、AST 活性以及肝臟SOD、GSH-Px 和MDA 氧化應激指標。

        2)肝臟甘油三酯含量的檢測[7]量取500 μL 肝臟勻漿液,充分混合于4 mL 氯仿-甲醇(體積比2∶1)脂質抽提緩沖液中,置于4 ℃過夜,8 000 r/min 離心10 min。將下層含脂質的有機相轉至EP 管中干燥,用甘油三酯檢測試劑盒測定分離出的脂質。

        3)肝臟游離脂肪酸含量的檢測 按照試劑盒說明書測定小鼠游離脂肪酸的含量。

        4)肝臟炎癥因子的測定 按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書測定白介素IL-6、腫瘤壞死因子TNF-α、干擾素IFN-γ 的含量。

        5)肝臟Nrf-2,NF-κB 和腸道ZO-1、Occludin、Claudin 基因的表達 提取肝臟和腸道組織的總RNA,反轉錄得到cDNA。用CFX96 熒光定量PCR 儀測定基因表達。各引物序列見表1。

        表1 實時定量PCR 引物Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

        6)腸道菌群測定 對小鼠糞便大腸桿菌、乳桿菌和雙歧桿菌分別采用EMB、LBS 和BBL 培養(yǎng)基測定。

        2 結果與討論

        2.1 植物乳桿菌C181 對酒精肝損傷小鼠肝臟甘油三酯和游離脂肪酸的影響

        為研究植物乳桿菌C181 對酒精引起的小鼠肝臟脂肪堆積的影響,檢測小鼠肝臟中的甘油三酯含量,結果見圖1。酒精模型組小鼠與空白對照組小鼠相比,肝臟中TG 的含量明顯升高,而灌胃植物乳桿菌C181 后小鼠的TG 含量明顯降低。游離脂肪酸是導致氧化應激的主要物質之一,活性氧自由基和活性氮自由基被游離脂肪酸誘導生成,造成小鼠機體內的抗氧化機制失衡,最后損傷肝臟組織。由圖1 可知,灌胃小鼠酒精4 周,其肝臟中游離脂肪酸的含量明顯上升。植物乳桿菌能顯著降低游離脂肪酸的含量,與空白對照組相比,沒有顯著性差異。

        圖1 植物乳桿菌C181 對酒精肝損傷小鼠肝臟甘油三酯和游離脂肪酸的影響Fig.1 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on liver triglyceride and free fatty acid in chronic alcohol-induced mice

        2.2 植物乳桿菌C181 對酒精肝損傷小鼠的血清中的ALT、AST 活性和肝臟氧化應激的影響

        ALT 和AST 是肝細胞重要的酶,診斷肝細胞受損重要的指標。正常條件下,小鼠的血清中這兩種酶的活性很低。當肝細胞受損時,細胞膜的通透性增加,這兩種酶進入血液中,血清中的酶活性顯著增強,反映出肝細胞受損程度,是重要的檢測肝功能的指標[7]。由圖2 可知,酒精肝損傷模型組小鼠的血清中AST 和ALT 活性顯著高于對照組小鼠,植物乳桿菌C181 能夠顯著降低酒精引起的血漿AST 和ALT 活性的升高,并與劑量呈正相關。綜上,植物乳桿菌C181 能改善過量酒精攝入引起的小鼠肝損傷。

        圖2 植物乳桿菌C181 對小鼠血清中AST、ALT活性的影響Fig.2 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on serum ALT,AST in chronic alcohol-induced mice

        肝臟中的脂肪病變能夠產生活性氧,對肝臟造成氧化損傷,從而加重非酒精性脂肪肝的病變程度。線粒體是脂肪氧化的主要場所,脂肪在肝細胞中積累的主要原因是線粒體發(fā)生異常,而線粒體異常使活性氧增多,加劇脂質過氧化和細胞因子的釋放,最終導致細胞死亡,這是一種惡性循環(huán),因此及時有效清除非酒精性脂肪肝產生的大量活性氧,對延緩/治療非酒精性脂肪肝具有十分重要的意義[9]。Forsyth 等[10]利用慢性酒精性肝損傷模型證明益生菌LGG 能有效降低酒精引起的氧化應激,維持腸屏障功能,改善內毒素血癥和肝損傷,進而改善酒精性脂肪性肝病。由圖3 可知,與正常組相比,酒精模型組SOD 和GSH 水平顯著降低,MDA 含量顯著升高。給予植物乳桿菌C181灌胃后,各項指標均顯著改善,其中,中劑量組和高劑量組與對照組相比,無顯著差異。本研究結果與先前的報道[11-12]相似,證明益生菌可改善酒精引起的肝臟嚴重氧化損傷,也說明植物乳桿菌C181具有很強的抗氧化能力。

        圖3 植物乳桿菌C181 對酒精肝損傷小鼠肝臟中SOD、GSH、MDA 的影響Fig.3 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on liver SOD、GSH and MDA in chronic alcohol-induced mice

        2.3 植物乳桿菌C181 對酒精肝損傷小鼠肝臟炎癥因子的影響

        大量研究認為,在酒精性肝病發(fā)生、發(fā)展過程中細胞炎癥因子具有非常重要的作用。內毒素對Kupffer 細胞(庫弗氏細胞,定居于肝臟內的巨噬細胞,在酒精性肝病中扮演重要角色)的激活除了會產生大量的自由基外,還會產生腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)、γ-干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)等細胞炎性因子,它們損害人體正常細胞和組織,進而通過多種途徑引起肝損傷。具有多種生物學功能的細胞因子TNF-α,是重要的調節(jié)因子,與免疫反應和炎癥反應相關。研究表明,TNF-α 可通過與細胞膜上的受體結合,增加胞內活性氧的產量,這些活性氧能夠損傷線粒體成分,如蛋白質、磷脂和線粒體DNA,誘導細胞凋亡[13]。

        由表2 可知,酒精模型組促炎因子TNF-α、IL-6 和IFN-γ 的水平顯著升高,抗炎因子IL-10的水平顯著降低。灌胃植物乳桿菌C181 后,促炎因子分泌量顯著降低,試驗結束時接近正常對照組水平,其中IFN-γ 的含量甚至低于對照組,而IL-10 的水平顯著升高。多項研究表明,益生菌通過促進促炎和抗炎因子的平衡來調節(jié)機體免疫失衡。Segawa 等[5]試驗結果顯示,口服加熱至死的短乳桿菌SBC8803,可以降低酒精誘導小鼠肝臟中TNF-α 的mRNA 表達量。Hong 等[14]也發(fā)現(xiàn)灌胃鼠李糖乳桿菌R0011 和嗜酸乳桿菌R0052 或者其發(fā)酵上清液,可以顯著降低酒精肝損傷小鼠肝臟中TLR4,TNF-a 和 IL-1 等炎癥因子的表達。

        表2 植物乳桿菌C181 對酒精肝損傷小鼠肝臟炎癥因子的影響Table 2 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on liver inflammation factors in chronic alcohol-induced mice

        2.4 植物乳桿菌C181 對酒精肝損傷的小鼠中肝臟Nrf-2,NF-κB 基因表達的影響

        紅細胞核因子(Nrf-2)是最近被認為的治療酒精肝損傷的靶因子。Nrf-2 作為核轉錄因子,通過與抗氧化反應元件的相互作用,在多種防御基因:解毒酶、抗氧化酶等防御基因中起重要作用[15]。Nrf-2 與細胞質中的特異性抑制因子相結合,導致Nrf-2 的活性受到抑制。在氧化刺激下,Nrf-2 與抑制因子分離,轉運到細胞核并與轉錄因子結合。然后,Nfr-2 復合物與抗氧化反應元件(ARE)結合,促進抗氧化基因的轉錄。乙醇誘導的氧化壓力及腸道屏障破壞引起的內毒素、脂多糖升高,從而導致炎癥,它們是酒精肝損傷的重要病理指標。腸屏障損傷被認為是酒精性內毒素血癥的主要原因之一。腸屏障損傷引起的腸內脂多糖(LPS)增加,可能通過促進肝臟炎癥過程在ALD的發(fā)病中起重要作用,這種增強的炎癥反應會進一步損害腸道屏障功能。脂多糖與Toll 樣受體TLR4 結合誘導了NF-κB 基因的活性,促使細胞因子(cytokines)和趨化因子(chemokines)等炎癥因子的產生,這些過度產生的分子最終導致肝臟慢性炎癥的惡性循環(huán)[16]。

        本研究結果表明:植物乳桿菌C181 顯著提高了酒精誘導小鼠肝臟中Nrf-2 基因的表達水平,并且降低了NF-κB 的表達水平。Ahmed 等[17]研究了Nrf-2 和NF-κB 的相互作用,證明Nrf-2 的激活可以抑制NF-κB 的表達。

        2.5 植物乳桿菌C181 對酒精肝損傷小鼠腸道菌群的影響

        2009年,Keshavarzian 等[18]通過慢性酒精性肝損傷大鼠模型實驗,發(fā)現(xiàn)酒精引起肝損傷外腸道出現(xiàn)損傷,大鼠腸道的通透性增加,內毒素腸滲漏。在酒精性肝病中出現(xiàn)腸道損傷的原因可以用“肝腸軸”原理解釋。酒精性肝病發(fā)生后,肝臟細胞合成并釋放大量炎癥因子,破壞腸黏膜細胞的緊密連接,造成腸道損傷。酒精性肝病造成腸道損傷后,患有酒精肝的小鼠腸道中內毒素透過小腸黏膜進入血液,并進入肝臟,加重肝臟的損傷。本文對大腸桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌進行定量分析,研究腸道菌群變化與酒精肝損傷之間的關系。各組糞便樣品中細菌定量分析結果見圖5。正常對照組和酒精模型組相比,大腸桿菌數(shù)量顯著增高了1 個數(shù)量級,攝入植物乳桿菌C181 后大腸桿菌的數(shù)量顯著下降,與對照組比差異不顯著。與對照組相比,酒精模型組中的乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量呈現(xiàn)顯著下降,下降1 個數(shù)量級。攝入植物乳桿菌C181 后,乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量都顯著提高,高劑量組接近對照組,其中乳酸桿菌的數(shù)量甚至高出對照組2 個數(shù)量級。

        圖4 植物乳桿菌C181 對酒精肝損傷小鼠肝臟Nrf-2,NF-κB mRNA 表達的影響Fig4 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on liver Nrf-2,NF-κB mRNA levels in chronic alcohol-induced mice

        圖5 植物乳桿菌C181 對酒精肝損傷小鼠腸道菌群的影響Fig.5 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on intestinal floras in chronic alcohol-induced mice

        2.6 植物乳桿菌C181 對酒精肝損傷小鼠腸道相關基因表達的影響

        Zhong 等[19]通過酒精性肝病小鼠模型證明慢性酒精會導致腸道緊密連接受損,腸道通透性升高,進而導致脂多糖吸收量增加,最終導致肝臟損傷。Kirpich 等[20]發(fā)現(xiàn)益生菌通過調整腸道菌群和肝臟酶活水平緩解患者的酒精性肝損傷。腸上皮細胞屏障主要由緊密連接控制,它是腸黏膜屏障具有選擇通透性的基礎,以維持機體內環(huán)境的穩(wěn)定。由于緊密連結蛋白ZO-1、Occludin、Claudin 是構成緊密連結的重要組成成分[21],因此對ZO-1、Occludin、Claudin 的表達情況進行研究。圖6 結果顯示,4 周慢性酒精攝入后,ZO-1、Occludin、Claudin 的mRNA 表達水平明顯下降。加入植物乳桿菌C181 后,三者mRNA 的表達水平明顯升高,并與劑量呈正相關,表明植物乳桿菌C181 能有效改善慢性酒精引起的腸道屏障完整性、通透性相關基因的表達水平。

        圖6 植物乳桿菌C181 對酒精肝損傷小鼠腸道ZO-1、Occludin 和Claudin 基因表達的影響Fig.6 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on intestinal ZO-1,Occludin and Claudin mRNA levels in chronic alcohol-induced mice

        3 結論

        本研究表明:山西老陳醋源植物乳桿菌C181可以通過上調酒精誘導小鼠肝臟中紅細胞核因子Nrf-2,下調NF-κB 基因的表達水平,從而調節(jié)肝臟的氧化應激和炎癥因子的分泌,改善緩減酒精引起肝損傷。另外,C181 還顯著提高了腸道緊密連接蛋白相關基因ZO-1、Claudin 和Occludin 的表達,增強了腸道黏膜屏障功能,維持腸道菌群平衡和內環(huán)境的穩(wěn)定,達到預防酒精性肝病的目的。本文為益生菌的酒精肝損傷預防機制以及保肝護肝微生態(tài)制劑的開發(fā)提供了基礎數(shù)據(jù)。

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