余兆碩，汪惠勤，高觀禎，柯李晶*，周建武，饒平凡，余陳歡

（1 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院-浙江工商大學(xué)食品營養(yǎng)科學(xué)聯(lián)合研究中心 杭州310035 2 中國科學(xué)院腫瘤與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心 杭州310018）

河蜆（Freshwater clam，Corbicula fluminea）作為我國重要經(jīng)濟貝類之一，廣泛分布于我國東南沿海地區(qū)。河蜆不僅肉質(zhì)鮮美，其經(jīng)蒸煮而成的河蜆湯也是東南亞地區(qū)自古用于保護肝臟的食療驗方。我國經(jīng)典醫(yī)書《唐本草》與《本草綱目》指出，河蜆為肝病防治的妙藥?，F(xiàn)代藥理試驗證實，河蜆湯可有效緩解化學(xué)性肝損傷，改善非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）[1]，并可通過降低絲裂原活化蛋白激酶和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）蛋白的活化從而抑制活化巨噬細胞的炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)機體免疫[2-3]。

目前，河蜆湯中分子組分的研究日益豐富，其脂肪酸組分可通過加快促進膽汁酸的肝生物合成，從而降低高脂血癥大鼠的血漿膽固醇水平[4-5]。河蜆多肽對乙醇誘導(dǎo)的肝細胞損傷也有較顯著的干預(yù)作用[6]。作為河蜆湯中的抗氧化成分，植物甾醇可增強血漿抗氧化能力[7]，促進脂質(zhì)代謝，并可有效防止脂質(zhì)過氧化造成的動脈粥樣硬化。此外，不少學(xué)者從河蜆中分離提取出具有較強抗氧化能力的多糖[8-9]。然而，河蜆湯的主要有效組分尚不明確，且這些分子組分間協(xié)同互作關(guān)系仍未清晰。此前，已發(fā)現(xiàn)在簡單蒸煮（沸水加熱1 h）而成的河蜆湯中存在穩(wěn)定的膠體體系[10]。隨著熱加工的開展，河蜆組織中細胞破裂，各成分有序遷移至水相，并組裝形成天然食源納米顆粒（Food nanoparticles，F(xiàn)NPs），其平均粒徑約為76 nm，表面帶負電荷，主要由多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)組成，且裝載有植物甾醇、鳥氨酸、牛磺酸等小分子活性成分[11]，有望發(fā)揮護肝功效。至此，亟需驗證河蜆湯FNPs 是否為河蜆湯生物活性的功能單元。

長爪沙鼠（Meriones unguieulataus，MU），因其脂質(zhì)代謝在諸多方面與人體相接近，而被廣泛作為脂質(zhì)代謝研究的模型動物?？紤]到FNPs 的尺寸，實驗中設(shè)計了FNPs 的不同給藥方式，探究口服與灌胃方式對機體的作用差異。研究河蜆湯食源納米顆粒對于非酒精性脂肪肝動物的影響，有助于闡明河蜆湯的護肝機理，完善食品-人體互作機制，并促進食源納米顆粒作為新型天然納米生物材料的開發(fā)應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮河蜆，由臺灣花蓮立川水產(chǎn)場贈送；長爪沙鼠（SPF 級），購于浙江省動物科學(xué)研究所。

1.2 主要試劑

脂質(zhì)含量（TG、TC）、肝功能指標(biāo)（血漿及肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶AST 和谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT）試劑盒，南京建成生物工程研究所；超濾管（分子量100 ku），美國Millipore 公司；氯仿、甲醇等（分析純級），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Milli-Q 超純水，美國Millipore 公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

激光粒度儀Nano-ZS，英國Malvern 公司；熒光倒置顯微鏡（DMI3000 B），美國Leica 公司；多功能鈣流檢測工作站（FlexStation 3），美國Molecular Devices 公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 河蜆湯及納米顆粒的制備 將河蜆浸泡除沙2～3 h，洗凈后按1∶1（m/V）比例與水混合，沸水煮60 min，收集剩余溶液，冷卻到室溫，21 500×g 離心15 min，除去沉淀，所得上清液即河蜆湯。將其分裝后置于-20 ℃冷凍待用。取10 mL 新鮮或解凍后恢復(fù)常溫的河蜆湯加到超濾管（100 ku）中，于5 000×g 離心轉(zhuǎn)速下常溫離心20 min。超濾管中截留的顆粒用Milli Q 水重懸，同樣條件下再離心1 次，確保除去超濾管上吸附的非顆粒成分。最后將截留于超濾管上的顆粒同體積milli Q 水重懸，所得溶液為超濾截留納米顆粒組分。

1.4.2 長爪沙鼠非酒精性脂肪肝模型的構(gòu)建

1）由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院負責(zé)購買長爪沙鼠并進行環(huán)境適應(yīng)飼養(yǎng)。

2）高脂飼料配方 80.5%的基礎(chǔ)飼料與19.5%的高脂成分（蛋黃粉10%，豬油7%，膽固醇2%，3 號膽鹽0.5%）。

3）長爪沙鼠經(jīng)馴化后，對每只沙鼠稱重并記錄，按每5 只/組隨機分組，每天9∶00 am 和4∶00 pm 按時喂食。

1.4.3 動物分組及給藥 動物分組（4 組）：正常組（Control），河蜆湯納米顆粒口服組（Oral），灌胃組（Gavage）及高脂組（HFD）?？诜M，每天9∶00 am，按每只8 mL/d 給食，連續(xù)喂養(yǎng)4 周；灌胃組，每天3 次，按每只0.7 mL/次+自由飲水給食。實驗喂食結(jié)束后，將各組沙鼠處死。所有的程序遵循浙江省醫(yī)學(xué)院動物護理和使用委員會的標(biāo)準(zhǔn)（2016R10031）。

1.4.4 血漿及肝臟指標(biāo)的測定

1）血漿中甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）的測定 使用含有肝素的注射器，從尾靜脈采血，血樣立即在4 ℃，400×g 離心10 min。收集的血漿須在12 h 內(nèi)分析。按照酶法試劑盒方法檢測。

2）AST 和ALT 的測定 取出0.2 g 肝臟研碎，注意低溫、快速，隨后加入4 mL 氯仿-甲醇混合萃取液（V氯仿∶V甲醇=2∶1），于4 ℃，1 500×g 離心10 min。取0.1 mL 上清液與0.1 mL Triton X-100充分混合，最后在氮氣下蒸干溶劑。

3）肝臟組織切片染色 將剩余的沙鼠肝臟在4%多聚甲醛中浸泡固定3 d，取出后放入70%乙醇溶液中，取出脫水，石蠟包埋切片。片的厚度為6～10 μm。隨后HE 染色，顯微鏡下觀察。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理與分析 數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（± s）表示，利用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗，P≤0.05 或P≤0.01 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 河蜆湯FNPs 膠體性質(zhì)

按河蜆與水1∶1（m/V）比例，煮沸60 min 的條件，得到呈乳白透明狀的河蜆湯，采用動態(tài)光散射技術(shù)（Dynamic light scattering，DLS）檢測其粒徑。經(jīng)超濾截留，河蜆湯中納米顆粒粒徑為（77.52±1.50）nm，ζ-電位為（-13.4±0.60）mV。

2.2 FNPs 對非酒精性脂肪肝長爪沙鼠血脂的影響

表1 與表2 顯示，暴露在高脂飲食4 周后，高脂組長爪沙鼠肝臟各項指標(biāo)均顯著升高（P＜0.05），說明已成功建立非酒精性脂肪肝長爪沙鼠模型。與高脂肪組相比，灌胃組與口服組的長爪沙鼠血漿中TC 與TG 均有不同程度的下降，其中灌胃組和口服組的TG 水平下降不顯著，而TC 水平均極顯著下降（P＜0.01）。與正常組相比，口服組的TC 與TG 水平變化不顯著。

2.3 FNPs 對非酒精性脂肪肝長爪沙鼠肝臟指數(shù)的影響

由表2 可看出，與高脂組相比，無論灌胃組還是口服組TC、TG、AST 與ALT 均不同程度地下降，其中肝臟中TC、AST 均極顯著下降（P＜0.01）。與正常組相比，無論灌胃組還是口服組TC、TG、AST 與ALT 均無顯著差異。同時，以上肝臟4 項指標(biāo)中，在TC、TG、AST 等3 項指標(biāo)，口服組均優(yōu)于灌胃組，而口服組與灌胃組的ALT 指標(biāo)并無顯著差異。

表1 各組長爪沙鼠的血脂指數(shù)Table 1 Blood lipid level in MU of each group

表2 各組長爪沙鼠的肝臟指數(shù)Table 2 Hepatic index in MU of different groups

2.4 長爪沙鼠肝臟組織切片HE 染色觀察

由圖1 可看出，肝臟組織切片HE 染色結(jié)果顯示：高脂組肝臟組織中出現(xiàn)明顯的肝細胞上點狀和灶狀壞死，甚至有連片趨勢。灌胃組中灶狀壞死情況相比高脂組有所改善，而其胞漿內(nèi)微小油滴仍清晰可見?？诜M比灌胃組更接近正常組情況，無明顯灶狀壞死且組織形態(tài)更完整。

3 討論

河蜆湯FNPs 可有效改善高脂環(huán)境誘導(dǎo)的高脂血癥和非酒精性脂肪肝，說明FNPs 也是河蜆湯發(fā)揮護肝效應(yīng)的重要組分。對FNPs 進行成分分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NPs 主要由多糖、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)組成，且包含了鳥氨酸、?；撬峒爸参镧薮嫉染哂凶o肝活性的小分子，這可能貢獻了FNPs 的護肝效果。

圖1 各組長爪沙鼠肝臟組織切片HE 染色Fig.1 Histochemical stains of MU liver sections of different groups

比較口服和灌胃兩種方式對長爪沙鼠高脂模型的血漿和肝臟指數(shù)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)兩種喂食方式下，河蜆湯納米顆粒均可明顯地改善沙鼠脂肪肝狀況。相比灌胃組數(shù)據(jù)，口服組長爪沙鼠的血漿和肝臟指數(shù)，特別在血漿TC，肝臟TG 上明顯優(yōu)于灌胃組（P＜0.05）。此外，從肝臟組織切片HE 染色結(jié)果也可看出明顯差異。灌胃組沙鼠肝細胞上點狀和灶狀壞死明顯比口服組沙鼠的多。也有研究表明，口服納米化后的SOD 酶的降血糖作用優(yōu)于灌胃處理[13]。口服和灌胃喂食最大的差異在于：口服直飲方式中，河蜆湯納米顆粒從入口開始，就與口腔黏膜作用。相比于灌胃喂食方式，口服直飲方式的河蜆湯納米顆粒有更多的時間和更大的接觸面積作用于上消化道黏膜免疫細胞。納米顆粒的作用方式有別于單分子成分經(jīng)血轉(zhuǎn)運并吸收作用的方式，其亦可直接被黏膜免疫吞噬細胞吞噬，從而發(fā)揮其生理活性作用。近來發(fā)現(xiàn)，食源性納米顆?？芍苯优c口腔及腹腔黏膜的巨噬細胞相互作用，發(fā)揮調(diào)節(jié)胞內(nèi)自由基的積極效應(yīng)[14-15]，這說明食源性納米顆粒與消化道之間的相互作用值得進一步探討。

長爪沙鼠非酒精性脂肪肝模型實驗中，河蜆湯納米顆粒經(jīng)口服改善的肝臟指標(biāo)顯著優(yōu)于經(jīng)灌胃的肝臟指標(biāo)，顯示消化道黏膜可能是河蜆納米顆粒發(fā)揮生理活性的主要場所。

4 結(jié)論

1）基于FNPs 作用于非酒精性脂肪肝長爪沙鼠的實驗表明，F(xiàn)NPs 可顯著降低血漿及肝臟中TC 及AST 水平，并不同程度地降低血漿TC、肝臟TG 及AST 水平，有效改善高脂血癥及高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝，說明FNPs 為河蜆湯護肝活性的功能單元。

2）FNPs 口服喂養(yǎng)效果優(yōu)于灌胃喂養(yǎng)，這可能是FNPs 顆粒更易被上消化道黏膜細胞所捕獲，從而發(fā)揮更強的生物活性作用。