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        河蜆湯食源納米顆粒對(duì)非酒精性脂肪肝長(zhǎng)爪沙鼠的影響

        2021-03-06 07:36:20余兆碩汪惠勤高觀禎柯李晶周建武饒平凡余陳歡
        中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2021年2期
        關(guān)鍵詞:沙鼠高脂灌胃

        余兆碩,汪惠勤,高觀禎,柯李晶*,周建武,饒平凡,余陳歡

        (1 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院-浙江工商大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)科學(xué)聯(lián)合研究中心 杭州310035 2 中國(guó)科學(xué)院腫瘤與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 杭州310018)

        河蜆(Freshwater clam,Corbicula fluminea)作為我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)貝類之一,廣泛分布于我國(guó)東南沿海地區(qū)。河蜆不僅肉質(zhì)鮮美,其經(jīng)蒸煮而成的河蜆湯也是東南亞地區(qū)自古用于保護(hù)肝臟的食療驗(yàn)方。我國(guó)經(jīng)典醫(yī)書《唐本草》與《本草綱目》指出,河蜆為肝病防治的妙藥?,F(xiàn)代藥理試驗(yàn)證實(shí),河蜆湯可有效緩解化學(xué)性肝損傷,改善非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)[1],并可通過降低絲裂原活化蛋白激酶和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)蛋白的活化從而抑制活化巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[2-3]。

        目前,河蜆湯中分子組分的研究日益豐富,其脂肪酸組分可通過加快促進(jìn)膽汁酸的肝生物合成,從而降低高脂血癥大鼠的血漿膽固醇水平[4-5]。河蜆多肽對(duì)乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷也有較顯著的干預(yù)作用[6]。作為河蜆湯中的抗氧化成分,植物甾醇可增強(qiáng)血漿抗氧化能力[7],促進(jìn)脂質(zhì)代謝,并可有效防止脂質(zhì)過氧化造成的動(dòng)脈粥樣硬化。此外,不少學(xué)者從河蜆中分離提取出具有較強(qiáng)抗氧化能力的多糖[8-9]。然而,河蜆湯的主要有效組分尚不明確,且這些分子組分間協(xié)同互作關(guān)系仍未清晰。此前,已發(fā)現(xiàn)在簡(jiǎn)單蒸煮(沸水加熱1 h)而成的河蜆湯中存在穩(wěn)定的膠體體系[10]。隨著熱加工的開展,河蜆組織中細(xì)胞破裂,各成分有序遷移至水相,并組裝形成天然食源納米顆粒(Food nanoparticles,F(xiàn)NPs),其平均粒徑約為76 nm,表面帶負(fù)電荷,主要由多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)組成,且裝載有植物甾醇、鳥氨酸、牛磺酸等小分子活性成分[11],有望發(fā)揮護(hù)肝功效。至此,亟需驗(yàn)證河蜆湯FNPs 是否為河蜆湯生物活性的功能單元。

        長(zhǎng)爪沙鼠(Meriones unguieulataus,MU),因其脂質(zhì)代謝在諸多方面與人體相接近,而被廣泛作為脂質(zhì)代謝研究的模型動(dòng)物??紤]到FNPs 的尺寸,實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了FNPs 的不同給藥方式,探究口服與灌胃方式對(duì)機(jī)體的作用差異。研究河蜆湯食源納米顆粒對(duì)于非酒精性脂肪肝動(dòng)物的影響,有助于闡明河蜆湯的護(hù)肝機(jī)理,完善食品-人體互作機(jī)制,并促進(jìn)食源納米顆粒作為新型天然納米生物材料的開發(fā)應(yīng)用。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        新鮮河蜆,由臺(tái)灣花蓮立川水產(chǎn)場(chǎng)贈(zèng)送;長(zhǎng)爪沙鼠(SPF 級(jí)),購(gòu)于浙江省動(dòng)物科學(xué)研究所。

        1.2 主要試劑

        脂質(zhì)含量(TG、TC)、肝功能指標(biāo)(血漿及肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶AST 和谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT)試劑盒,南京建成生物工程研究所;超濾管(分子量100 ku),美國(guó)Millipore 公司;氯仿、甲醇等(分析純級(jí)),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Milli-Q 超純水,美國(guó)Millipore 公司。

        1.3 主要儀器與設(shè)備

        激光粒度儀Nano-ZS,英國(guó)Malvern 公司;熒光倒置顯微鏡(DMI3000 B),美國(guó)Leica 公司;多功能鈣流檢測(cè)工作站(FlexStation 3),美國(guó)Molecular Devices 公司。

        1.4 試驗(yàn)方法

        1.4.1 河蜆湯及納米顆粒的制備 將河蜆浸泡除沙2~3 h,洗凈后按1∶1(m/V)比例與水混合,沸水煮60 min,收集剩余溶液,冷卻到室溫,21 500×g 離心15 min,除去沉淀,所得上清液即河蜆湯。將其分裝后置于-20 ℃冷凍待用。取10 mL 新鮮或解凍后恢復(fù)常溫的河蜆湯加到超濾管(100 ku)中,于5 000×g 離心轉(zhuǎn)速下常溫離心20 min。超濾管中截留的顆粒用Milli Q 水重懸,同樣條件下再離心1 次,確保除去超濾管上吸附的非顆粒成分。最后將截留于超濾管上的顆粒同體積milli Q 水重懸,所得溶液為超濾截留納米顆粒組分。

        1.4.2 長(zhǎng)爪沙鼠非酒精性脂肪肝模型的構(gòu)建

        1)由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院負(fù)責(zé)購(gòu)買長(zhǎng)爪沙鼠并進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)飼養(yǎng)。

        2)高脂飼料配方 80.5%的基礎(chǔ)飼料與19.5%的高脂成分(蛋黃粉10%,豬油7%,膽固醇2%,3 號(hào)膽鹽0.5%)。

        3)長(zhǎng)爪沙鼠經(jīng)馴化后,對(duì)每只沙鼠稱重并記錄,按每5 只/組隨機(jī)分組,每天9∶00 am 和4∶00 pm 按時(shí)喂食。

        1.4.3 動(dòng)物分組及給藥 動(dòng)物分組(4 組):正常組(Control),河蜆湯納米顆??诜M(Oral),灌胃組(Gavage)及高脂組(HFD)??诜M,每天9∶00 am,按每只8 mL/d 給食,連續(xù)喂養(yǎng)4 周;灌胃組,每天3 次,按每只0.7 mL/次+自由飲水給食。實(shí)驗(yàn)喂食結(jié)束后,將各組沙鼠處死。所有的程序遵循浙江省醫(yī)學(xué)院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)(2016R10031)。

        1.4.4 血漿及肝臟指標(biāo)的測(cè)定

        1)血漿中甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)的測(cè)定 使用含有肝素的注射器,從尾靜脈采血,血樣立即在4 ℃,400×g 離心10 min。收集的血漿須在12 h 內(nèi)分析。按照酶法試劑盒方法檢測(cè)。

        2)AST 和ALT 的測(cè)定 取出0.2 g 肝臟研碎,注意低溫、快速,隨后加入4 mL 氯仿-甲醇混合萃取液(V氯仿∶V甲醇=2∶1),于4 ℃,1 500×g 離心10 min。取0.1 mL 上清液與0.1 mL Triton X-100充分混合,最后在氮?dú)庀抡舾扇軇?/p>

        3)肝臟組織切片染色 將剩余的沙鼠肝臟在4%多聚甲醛中浸泡固定3 d,取出后放入70%乙醇溶液中,取出脫水,石蠟包埋切片。片的厚度為6~10 μm。隨后HE 染色,顯微鏡下觀察。

        1.4.5 數(shù)據(jù)處理與分析 數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(± s)表示,利用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),P≤0.05 或P≤0.01 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 河蜆湯FNPs 膠體性質(zhì)

        按河蜆與水1∶1(m/V)比例,煮沸60 min 的條件,得到呈乳白透明狀的河蜆湯,采用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(Dynamic light scattering,DLS)檢測(cè)其粒徑。經(jīng)超濾截留,河蜆湯中納米顆粒粒徑為(77.52±1.50)nm,ζ-電位為(-13.4±0.60)mV。

        2.2 FNPs 對(duì)非酒精性脂肪肝長(zhǎng)爪沙鼠血脂的影響

        表1 與表2 顯示,暴露在高脂飲食4 周后,高脂組長(zhǎng)爪沙鼠肝臟各項(xiàng)指標(biāo)均顯著升高(P<0.05),說明已成功建立非酒精性脂肪肝長(zhǎng)爪沙鼠模型。與高脂肪組相比,灌胃組與口服組的長(zhǎng)爪沙鼠血漿中TC 與TG 均有不同程度的下降,其中灌胃組和口服組的TG 水平下降不顯著,而TC 水平均極顯著下降(P<0.01)。與正常組相比,口服組的TC 與TG 水平變化不顯著。

        2.3 FNPs 對(duì)非酒精性脂肪肝長(zhǎng)爪沙鼠肝臟指數(shù)的影響

        由表2 可看出,與高脂組相比,無(wú)論灌胃組還是口服組TC、TG、AST 與ALT 均不同程度地下降,其中肝臟中TC、AST 均極顯著下降(P<0.01)。與正常組相比,無(wú)論灌胃組還是口服組TC、TG、AST 與ALT 均無(wú)顯著差異。同時(shí),以上肝臟4 項(xiàng)指標(biāo)中,在TC、TG、AST 等3 項(xiàng)指標(biāo),口服組均優(yōu)于灌胃組,而口服組與灌胃組的ALT 指標(biāo)并無(wú)顯著差異。

        表1 各組長(zhǎng)爪沙鼠的血脂指數(shù)Table 1 Blood lipid level in MU of each group

        表2 各組長(zhǎng)爪沙鼠的肝臟指數(shù)Table 2 Hepatic index in MU of different groups

        2.4 長(zhǎng)爪沙鼠肝臟組織切片HE 染色觀察

        由圖1 可看出,肝臟組織切片HE 染色結(jié)果顯示:高脂組肝臟組織中出現(xiàn)明顯的肝細(xì)胞上點(diǎn)狀和灶狀壞死,甚至有連片趨勢(shì)。灌胃組中灶狀壞死情況相比高脂組有所改善,而其胞漿內(nèi)微小油滴仍清晰可見??诜M比灌胃組更接近正常組情況,無(wú)明顯灶狀壞死且組織形態(tài)更完整。

        3 討論

        河蜆湯FNPs 可有效改善高脂環(huán)境誘導(dǎo)的高脂血癥和非酒精性脂肪肝,說明FNPs 也是河蜆湯發(fā)揮護(hù)肝效應(yīng)的重要組分。對(duì)FNPs 進(jìn)行成分分析發(fā)現(xiàn),F(xiàn)NPs 主要由多糖、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)組成,且包含了鳥氨酸、?;撬峒爸参镧薮嫉染哂凶o(hù)肝活性的小分子,這可能貢獻(xiàn)了FNPs 的護(hù)肝效果。

        圖1 各組長(zhǎng)爪沙鼠肝臟組織切片HE 染色Fig.1 Histochemical stains of MU liver sections of different groups

        比較口服和灌胃兩種方式對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠高脂模型的血漿和肝臟指數(shù)數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)兩種喂食方式下,河蜆湯納米顆粒均可明顯地改善沙鼠脂肪肝狀況。相比灌胃組數(shù)據(jù),口服組長(zhǎng)爪沙鼠的血漿和肝臟指數(shù),特別在血漿TC,肝臟TG 上明顯優(yōu)于灌胃組(P<0.05)。此外,從肝臟組織切片HE 染色結(jié)果也可看出明顯差異。灌胃組沙鼠肝細(xì)胞上點(diǎn)狀和灶狀壞死明顯比口服組沙鼠的多。也有研究表明,口服納米化后的SOD 酶的降血糖作用優(yōu)于灌胃處理[13]??诜凸辔肝故匙畲蟮牟町愒谟冢嚎诜憋嫹绞街?,河蜆湯納米顆粒從入口開始,就與口腔黏膜作用。相比于灌胃喂食方式,口服直飲方式的河蜆湯納米顆粒有更多的時(shí)間和更大的接觸面積作用于上消化道黏膜免疫細(xì)胞。納米顆粒的作用方式有別于單分子成分經(jīng)血轉(zhuǎn)運(yùn)并吸收作用的方式,其亦可直接被黏膜免疫吞噬細(xì)胞吞噬,從而發(fā)揮其生理活性作用。近來(lái)發(fā)現(xiàn),食源性納米顆??芍苯优c口腔及腹腔黏膜的巨噬細(xì)胞相互作用,發(fā)揮調(diào)節(jié)胞內(nèi)自由基的積極效應(yīng)[14-15],這說明食源性納米顆粒與消化道之間的相互作用值得進(jìn)一步探討。

        長(zhǎng)爪沙鼠非酒精性脂肪肝模型實(shí)驗(yàn)中,河蜆湯納米顆粒經(jīng)口服改善的肝臟指標(biāo)顯著優(yōu)于經(jīng)灌胃的肝臟指標(biāo),顯示消化道黏膜可能是河蜆納米顆粒發(fā)揮生理活性的主要場(chǎng)所。

        4 結(jié)論

        1)基于FNPs 作用于非酒精性脂肪肝長(zhǎng)爪沙鼠的實(shí)驗(yàn)表明,F(xiàn)NPs 可顯著降低血漿及肝臟中TC 及AST 水平,并不同程度地降低血漿TC、肝臟TG 及AST 水平,有效改善高脂血癥及高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝,說明FNPs 為河蜆湯護(hù)肝活性的功能單元。

        2)FNPs 口服喂養(yǎng)效果優(yōu)于灌胃喂養(yǎng),這可能是FNPs 顆粒更易被上消化道黏膜細(xì)胞所捕獲,從而發(fā)揮更強(qiáng)的生物活性作用。

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