余兆碩，汪惠勤，高觀禎，柯李晶*，周建武，饒平凡，余陳歡

（1 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院-浙江工商大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)科學(xué)聯(lián)合研究中心 杭州310035 2 中國(guó)科學(xué)院腫瘤與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 杭州310018）

河蜆（Freshwater clam，Corbicula fluminea）作為我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)貝類之一，廣泛分布于我國(guó)東南沿海地區(qū)。河蜆不僅肉質(zhì)鮮美，其經(jīng)蒸煮而成的河蜆湯也是東南亞地區(qū)自古用于保護(hù)肝臟的食療驗(yàn)方。我國(guó)經(jīng)典醫(yī)書《唐本草》與《本草綱目》指出，河蜆為肝病防治的妙藥?，F(xiàn)代藥理試驗(yàn)證實(shí)，河蜆湯可有效緩解化學(xué)性肝損傷，改善非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）[1]，并可通過降低絲裂原活化蛋白激酶和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）蛋白的活化從而抑制活化巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[2-3]。

目前，河蜆湯中分子組分的研究日益豐富，其脂肪酸組分可通過加快促進(jìn)膽汁酸的肝生物合成，從而降低高脂血癥大鼠的血漿膽固醇水平[4-5]。河蜆多肽對(duì)乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷也有較顯著的干預(yù)作用[6]。作為河蜆湯中的抗氧化成分，植物甾醇可增強(qiáng)血漿抗氧化能力[7]，促進(jìn)脂質(zhì)代謝，并可有效防止脂質(zhì)過氧化造成的動(dòng)脈粥樣硬化。此外，不少學(xué)者從河蜆中分離提取出具有較強(qiáng)抗氧化能力的多糖[8-9]。然而，河蜆湯的主要有效組分尚不明確，且這些分子組分間協(xié)同互作關(guān)系仍未清晰。此前，已發(fā)現(xiàn)在簡(jiǎn)單蒸煮（沸水加熱1 h）而成的河蜆湯中存在穩(wěn)定的膠體體系[10]。隨著熱加工的開展，河蜆組織中細(xì)胞破裂，各成分有序遷移至水相，并組裝形成天然食源納米顆粒（Food nanoparticles，F(xiàn)NPs），其平均粒徑約為76 nm，表面帶負(fù)電荷，主要由多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)組成，且裝載有植物甾醇、鳥氨酸、牛磺酸等小分子活性成分[11]，有望發(fā)揮護(hù)肝功效。至此，亟需驗(yàn)證河蜆湯FNPs 是否為河蜆湯生物活性的功能單元。

長(zhǎng)爪沙鼠（Meriones unguieulataus，MU），因其脂質(zhì)代謝在諸多方面與人體相接近，而被廣泛作為脂質(zhì)代謝研究的模型動(dòng)物?？紤]到FNPs 的尺寸，實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了FNPs 的不同給藥方式，探究口服與灌胃方式對(duì)機(jī)體的作用差異。研究河蜆湯食源納米顆粒對(duì)于非酒精性脂肪肝動(dòng)物的影響，有助于闡明河蜆湯的護(hù)肝機(jī)理，完善食品-人體互作機(jī)制，并促進(jìn)食源納米顆粒作為新型天然納米生物材料的開發(fā)應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮河蜆，由臺(tái)灣花蓮立川水產(chǎn)場(chǎng)贈(zèng)送；長(zhǎng)爪沙鼠（SPF 級(jí)），購(gòu)于浙江省動(dòng)物科學(xué)研究所。

1.2 主要試劑

脂質(zhì)含量（TG、TC）、肝功能指標(biāo)（血漿及肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶AST 和谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT）試劑盒，南京建成生物工程研究所；超濾管（分子量100 ku），美國(guó)Millipore 公司；氯仿、甲醇等（分析純級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Milli-Q 超純水，美國(guó)Millipore 公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

激光粒度儀Nano-ZS，英國(guó)Malvern 公司；熒光倒置顯微鏡（DMI3000 B），美國(guó)Leica 公司；多功能鈣流檢測(cè)工作站（FlexStation 3），美國(guó)Molecular Devices 公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 河蜆湯及納米顆粒的制備 將河蜆浸泡除沙2～3 h，洗凈后按1∶1（m/V）比例與水混合，沸水煮60 min，收集剩余溶液，冷卻到室溫，21 500×g 離心15 min，除去沉淀，所得上清液即河蜆湯。將其分裝后置于-20 ℃冷凍待用。取10 mL 新鮮或解凍后恢復(fù)常溫的河蜆湯加到超濾管（100 ku）中，于5 000×g 離心轉(zhuǎn)速下常溫離心20 min。超濾管中截留的顆粒用Milli Q 水重懸，同樣條件下再離心1 次，確保除去超濾管上吸附的非顆粒成分。最后將截留于超濾管上的顆粒同體積milli Q 水重懸，所得溶液為超濾截留納米顆粒組分。

1.4.2 長(zhǎng)爪沙鼠非酒精性脂肪肝模型的構(gòu)建

1）由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院負(fù)責(zé)購(gòu)買長(zhǎng)爪沙鼠并進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)飼養(yǎng)。

2）高脂飼料配方 80.5%的基礎(chǔ)飼料與19.5%的高脂成分（蛋黃粉10%，豬油7%，膽固醇2%，3 號(hào)膽鹽0.5%）。

3）長(zhǎng)爪沙鼠經(jīng)馴化后，對(duì)每只沙鼠稱重并記錄，按每5 只/組隨機(jī)分組，每天9∶00 am 和4∶00 pm 按時(shí)喂食。

1.4.3 動(dòng)物分組及給藥 動(dòng)物分組（4 組）：正常組（Control），河蜆湯納米顆?？诜M（Oral），灌胃組（Gavage）及高脂組（HFD）?？诜M，每天9∶00 am，按每只8 mL/d 給食，連續(xù)喂養(yǎng)4 周；灌胃組，每天3 次，按每只0.7 mL/次+自由飲水給食。實(shí)驗(yàn)喂食結(jié)束后，將各組沙鼠處死。所有的程序遵循浙江省醫(yī)學(xué)院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)（2016R10031）。

1.4.4 血漿及肝臟指標(biāo)的測(cè)定

1）血漿中甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）的測(cè)定 使用含有肝素的注射器，從尾靜脈采血，血樣立即在4 ℃，400×g 離心10 min。收集的血漿須在12 h 內(nèi)分析。按照酶法試劑盒方法檢測(cè)。

2）AST 和ALT 的測(cè)定 取出0.2 g 肝臟研碎，注意低溫、快速，隨后加入4 mL 氯仿-甲醇混合萃取液（V氯仿∶V甲醇=2∶1），于4 ℃，1 500×g 離心10 min。取0.1 mL 上清液與0.1 mL Triton X-100充分混合，最后在氮?dú)庀抡舾扇軇?/p>

3）肝臟組織切片染色 將剩余的沙鼠肝臟在4%多聚甲醛中浸泡固定3 d，取出后放入70%乙醇溶液中，取出脫水，石蠟包埋切片。片的厚度為6～10 μm。隨后HE 染色，顯微鏡下觀察。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理與分析 數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（± s）表示，利用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P≤0.05 或P≤0.01 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 河蜆湯FNPs 膠體性質(zhì)

按河蜆與水1∶1（m/V）比例，煮沸60 min 的條件，得到呈乳白透明狀的河蜆湯，采用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)（Dynamic light scattering，DLS）檢測(cè)其粒徑。經(jīng)超濾截留，河蜆湯中納米顆粒粒徑為（77.52±1.50）nm，ζ-電位為（-13.4±0.60）mV。

2.2 FNPs 對(duì)非酒精性脂肪肝長(zhǎng)爪沙鼠血脂的影響

表1 與表2 顯示，暴露在高脂飲食4 周后，高脂組長(zhǎng)爪沙鼠肝臟各項(xiàng)指標(biāo)均顯著升高（P＜0.05），說明已成功建立非酒精性脂肪肝長(zhǎng)爪沙鼠模型。與高脂肪組相比，灌胃組與口服組的長(zhǎng)爪沙鼠血漿中TC 與TG 均有不同程度的下降，其中灌胃組和口服組的TG 水平下降不顯著，而TC 水平均極顯著下降（P＜0.01）。與正常組相比，口服組的TC 與TG 水平變化不顯著。

2.3 FNPs 對(duì)非酒精性脂肪肝長(zhǎng)爪沙鼠肝臟指數(shù)的影響

由表2 可看出，與高脂組相比，無(wú)論灌胃組還是口服組TC、TG、AST 與ALT 均不同程度地下降，其中肝臟中TC、AST 均極顯著下降（P＜0.01）。與正常組相比，無(wú)論灌胃組還是口服組TC、TG、AST 與ALT 均無(wú)顯著差異。同時(shí)，以上肝臟4 項(xiàng)指標(biāo)中，在TC、TG、AST 等3 項(xiàng)指標(biāo)，口服組均優(yōu)于灌胃組，而口服組與灌胃組的ALT 指標(biāo)并無(wú)顯著差異。

表1 各組長(zhǎng)爪沙鼠的血脂指數(shù)Table 1 Blood lipid level in MU of each group

表2 各組長(zhǎng)爪沙鼠的肝臟指數(shù)Table 2 Hepatic index in MU of different groups

2.4 長(zhǎng)爪沙鼠肝臟組織切片HE 染色觀察

由圖1 可看出，肝臟組織切片HE 染色結(jié)果顯示：高脂組肝臟組織中出現(xiàn)明顯的肝細(xì)胞上點(diǎn)狀和灶狀壞死，甚至有連片趨勢(shì)。灌胃組中灶狀壞死情況相比高脂組有所改善，而其胞漿內(nèi)微小油滴仍清晰可見?？诜M比灌胃組更接近正常組情況，無(wú)明顯灶狀壞死且組織形態(tài)更完整。

3 討論

河蜆湯FNPs 可有效改善高脂環(huán)境誘導(dǎo)的高脂血癥和非酒精性脂肪肝，說明FNPs 也是河蜆湯發(fā)揮護(hù)肝效應(yīng)的重要組分。對(duì)FNPs 進(jìn)行成分分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NPs 主要由多糖、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)組成，且包含了鳥氨酸、?；撬峒爸参镧薮嫉染哂凶o(hù)肝活性的小分子，這可能貢獻(xiàn)了FNPs 的護(hù)肝效果。

圖1 各組長(zhǎng)爪沙鼠肝臟組織切片HE 染色Fig.1 Histochemical stains of MU liver sections of different groups

比較口服和灌胃兩種方式對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠高脂模型的血漿和肝臟指數(shù)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)兩種喂食方式下，河蜆湯納米顆粒均可明顯地改善沙鼠脂肪肝狀況。相比灌胃組數(shù)據(jù)，口服組長(zhǎng)爪沙鼠的血漿和肝臟指數(shù)，特別在血漿TC，肝臟TG 上明顯優(yōu)于灌胃組（P＜0.05）。此外，從肝臟組織切片HE 染色結(jié)果也可看出明顯差異。灌胃組沙鼠肝細(xì)胞上點(diǎn)狀和灶狀壞死明顯比口服組沙鼠的多。也有研究表明，口服納米化后的SOD 酶的降血糖作用優(yōu)于灌胃處理[13]?？诜凸辔肝故匙畲蟮牟町愒谟冢嚎诜憋嫹绞街?，河蜆湯納米顆粒從入口開始，就與口腔黏膜作用。相比于灌胃喂食方式，口服直飲方式的河蜆湯納米顆粒有更多的時(shí)間和更大的接觸面積作用于上消化道黏膜免疫細(xì)胞。納米顆粒的作用方式有別于單分子成分經(jīng)血轉(zhuǎn)運(yùn)并吸收作用的方式，其亦可直接被黏膜免疫吞噬細(xì)胞吞噬，從而發(fā)揮其生理活性作用。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，食源性納米顆?？芍苯优c口腔及腹腔黏膜的巨噬細(xì)胞相互作用，發(fā)揮調(diào)節(jié)胞內(nèi)自由基的積極效應(yīng)[14-15]，這說明食源性納米顆粒與消化道之間的相互作用值得進(jìn)一步探討。

長(zhǎng)爪沙鼠非酒精性脂肪肝模型實(shí)驗(yàn)中，河蜆湯納米顆粒經(jīng)口服改善的肝臟指標(biāo)顯著優(yōu)于經(jīng)灌胃的肝臟指標(biāo)，顯示消化道黏膜可能是河蜆納米顆粒發(fā)揮生理活性的主要場(chǎng)所。

4 結(jié)論

1）基于FNPs 作用于非酒精性脂肪肝長(zhǎng)爪沙鼠的實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)NPs 可顯著降低血漿及肝臟中TC 及AST 水平，并不同程度地降低血漿TC、肝臟TG 及AST 水平，有效改善高脂血癥及高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝，說明FNPs 為河蜆湯護(hù)肝活性的功能單元。

2）FNPs 口服喂養(yǎng)效果優(yōu)于灌胃喂養(yǎng)，這可能是FNPs 顆粒更易被上消化道黏膜細(xì)胞所捕獲，從而發(fā)揮更強(qiáng)的生物活性作用。