彭 穎，何婉鶯，范 鑫，盧 琪，何小燕，潘思軼*

（1 華中農業(yè)大學食品科技學院 武漢430070 2 安琪酵母股份有限公司 湖北宜昌443003）

1963年，俞福惠等[1]發(fā)現(xiàn)二氫查爾酮及其衍生物可作為甜味劑，并從柑橘黃烷酮中提取了柚皮苷二氫查爾酮（Naringin DC）等。二氫查爾酮的甜味持續(xù)時間長，口感清爽，甜度高，熱量低，安全無毒，能有效的屏蔽苦味[2]。二氫查爾酮類化合物對糖尿病有一定作用。此外，二氫查爾酮類化合物具有藥效基團-2，6-二羥基苯乙酮結構，該基團有抗氧化作用，通過消除過氧化物、清除羥自由基來實現(xiàn)[3]。歐陽振宇[4]以柚皮渣為原料，超聲波輔助提取柚皮苷，并用D101 大孔樹脂分離富集，得到純度為83.7 %的柚皮苷；對柚皮苷在堿性條件下加壓并以鈀碳作為催化劑合成柚皮苷二氫查爾酮（Naringin DC），產率為85.2%。文獻[5]和[6]以超聲波輔助乙醇提取香柚皮中的柚皮苷，并用弱極性AB-8 樹脂分離純化柚皮苷，NaOH 作為洗脫劑，得到純度為77.26%的柚皮苷堿溶液，最后將該堿液在催化劑雷尼鎳的作用下，加氫合成Naringin DC。李晚誼等[7]研究表明云南甜茶有強的過敏作用，其抗過敏作用的有效成分是二氫查爾酮-4’-β-D 葡萄糖苷和二氫查爾酮-2’-β-D 葡萄糖苷。方旭兵等[8]研究表明龍血樹醇提取物龍血竭的主要成分——龍血素A 和龍血素B 均為二氫查爾酮類化合物，經對相關二氫查爾酮合成和修飾以及用HepG2 細胞進行抗肝癌腫瘤活性篩選，發(fā)現(xiàn)二氫查爾酮類化合物中F-18 和F-16 抗肝癌腫瘤活性較好。楊美琪[9]研究表明利用硅膠、大孔樹脂、MCI-CHP20P 及葡聚糖凝膠柱等分離方法，結合薄層色譜及HPLC 分析木棗棗根醇提物，得到含量較高的二氫查爾酮-4’-β-D-吡喃葡萄糖苷等16 個化合物[9]。目前，Naringin DC 的活性研究報道較少，本研究對其抗氧化活性和美白活性進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設備

柚皮苷標準品，上海源葉；Naringin DC 標準品，上海源葉；新橙皮苷二氫查爾酮標準品，上海源葉；ABTS，碧云天生物；酪氨酸酶，上海源葉；其它試劑均為分析純；Autodock vina 1.1.2，美國Scripps 研究所。EL204-IC 分析天平，美國METTLER TOLEDO 公司；5 mL 移液槍，美國Eppendorf 公司；Synergy TX 多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；Multiskan Go 全波長讀數(shù)儀，美國Thermo Scientific 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 ABTS 自由基清除能力測定 通過3.0 mg/mL 柚皮苷、1.0 mg/mL Naringin DC、0.30 mg/mL NHDC、0.0025 mg/mL 槲皮素與ABTS 自由基反應，測定其吸光值，繪制Trolox（0.15，0.30，0.60，0.90，1.20，1.50 mmol/L）標準曲線，計算其與Trolox 的相同清除能力時的用量。具體操作步驟：

1）在96 孔板的每個檢測孔中加入200 μL ABTS 工作液。

2）空白對照孔中加入10 μL 蒸餾水或PBS 等適當溶液，標準曲線檢測孔內加入10 μL 各種濃度的Trolox 標準溶液，樣品檢測孔內加入10 μL樣品，輕輕混勻。

3）室溫孵育2～6 min，于波長734 nm 處測定吸光度。

4）根據(jù)標準曲線計算樣品的總抗氧化能力，用Trolox 等效抗氧化能力（Trolox Equivalent Antioxidan Capacily，TEAC）來表示。

1.2.2 羥自由基清除能力測定 通過3.0 mg/mL柚皮苷、1.0 mg/mL Naringin DC、0.50 mg/mL NHDC、0.15 mg/mL 槲皮素與羥自由基反應，測定其吸光值，繪制Trolox（0.01，0.025，0.05，0.10，0.15 mg/L）標準曲線，計算其與Trolox 的當量，進而比較抗氧化能力強、弱。

按照表1 所列順序向酶標板中加入對應試劑，按表1 規(guī)定的條件操作，以Trolox 為標準品繪制標準曲線。

表1 樣品及Trolox 的抗氧化能力測定方法Table 1 Determination method of antioxidant capacity for sample and trolox

樣品的抗氧化能力根據(jù)式（1）進行計算?？寡趸芰χ狄訲rolox 相同抗氧化能力時的用量（μmol Trolox 物質的量/g）表示，即1 g 樣品相當于Trolox 的μmol 數(shù)。

式中，A樣品——樣品吸光度；A空白——樣品空白吸光度；ATrolox——Trolox 溶液吸光度；mTrolox——Trolox 溶液的物質的量（μmol）；m樣品——樣品的質量（mg）。

1.2.3 FRAP 法測定樣品的鐵離子還原能力 通過3.0 g/L 柚皮苷、1.0 g/L Naringin DC、0.30 g/L NHDC、0.025 mg/mL 槲皮素與ferric-TPTZ 自由基反應，測定其吸光值，繪制維生素C（25，50，100，200，400，800 μmol/L）標準曲線，計算其與維生素C 的物質的量，比較抗氧化能力強、弱。

在酶標板的每孔中，依次加入10 μL 不同濃度的維生素標準品溶液或樣品和300 μL 的ferric-TPTZ 工作液【300 mmol/L 醋酸鹽緩沖液（0.31 g 三水合醋酸鈉+1.6 mL 冰醋酸+超純水至100 mL，pH 3.6】、10 mmol/L TPTZ 的40 mmol/鹽酸溶液和20 mmol/L FeCl3·6H2O 溶液，以體積比10∶1∶1 混合），室溫反應30 min 后，于波長593 nm處用酶標儀測定其吸光度。吸光值的大小與樣品的抗氧化能力成正比。維生素C 的標準曲線配制濃度為：25，50，100，200，400，800 μmol/L，測定結果以維生素C 為參考標準，結果表示為μmol AAE/g 干重。平行測定3 次，結果取平均值計算。

1.2.4 ORAC 法測定樣品的氧自由基清除能力通過3.00 g/L 柚皮苷、1.00 g/L Naringin DC、3.00 g/L NHDC、0.0125 mg/mL 槲皮素與過氧自由基反應，測定其吸光值，繪制Trolox（62.5，125，250，500，500，1000 mol/L）標準曲線，計算其與Trolox的物質的量，比較抗氧化能力強、弱。

該方法以偶氮類化合物AAPH 作為過氧自由基來源，熒光素鈉鹽為熒光指示劑。將熒光素鈉鹽、AAPH 和水溶性維生素C 類似物Trolox 分別用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）溶解，在96 孔板中依次加入25 μL 各濃度的Trolox 標準品溶液和樣品以及200 μL 熒光光素鈉鹽溶液（8.68 nmol/L），然后，將孔板放入熒光酶標儀中，用Gene5 軟件編程操作，37 ℃預熱30 min，迅速加入AAPH 溶液25 μL（153 mmol/L），自動振蕩搖勻，在激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長528 nm 處用熒光酶標儀測定。初始吸光強度值記為f0，以后每隔1 min 測定一個點，共測定120 min，熒光強度分別記為f0，f1，f2…f120，根據(jù)公式（2）統(tǒng)計各濃度的曲線下面積AUC 值。ORAC 的含量越高，抗氧化能力越強。

Trolox 標準曲線配制濃度分別為62.5，125，250，500，1000 μmol/L，測定結果以Trolox 為參考標準，結果表示為μmol Trolox（TE）/g 干重。平行測定3 次，結果取平均值計算。

1.2.5 Naringin DC 與人銅鋅超氧化物歧化酶SOD 的分子對接 采用ChemBioDraw Ultra 14.0畫出化合物槲皮素和Naringin DC 的結構，然后用ChemBio3D Ultra 14.0 轉化為三維結構，并用Sybyl 軟件的MMFF94 力場進行優(yōu)化。人銅鋅超氧化物歧化酶SOD 的三維結構（PDB ID：3RE0）從RCSB 蛋白數(shù)據(jù)庫下載。銅鋅超氧化物歧化酶和化合物均使用AutodockTools 1.5.6 轉化為PDBQT格式。采用Autodock vina 1.1.2 進行分子對接。銅鋅超氧化物歧化酶活性位點的坐標設置為：size_x=15，size_y=15，size_z=15；center_x=1.346，center_y=-3.077，center_z=30.419。為了增加計算的準確度，將參數(shù)exhaustiveness 設置為20。除了特別說明，其它參數(shù)均采用默認值。最后，選取打分值最高的構象用PyMoL1.7.6 進行結果分析[10-12]。

1.2.6 酪氨酸酶活性抑制試驗 通過熊果苷（0.625，1.25，2.5，5，10 mg/mL）、柚皮苷（0.625，1.25，2.5，5，10 mg/mL）、Naringin DC（0.625，1.25，2.5，5，10 mg/mL）、NHDC（0.625，1.25，2.5，5，10 mg/mL）與酪氨酸酶反應測定其吸光值并繪制曲線，求出IC50值，進而比較抗氧化能力強、弱。

以多巴（L-DOPA）為底物，測定酪氨酸酶的活性。先將待測樣品用無水乙醇溶解，配制成質量濃度為1 mg/mL 的貯備液，再依次稀釋成不同濃度的樣品溶液。按表2所示，依次準確吸取不同濃度的樣品溶液，pH 6.8 的0.5 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液，0.5 mmol/L L-DOPA 溶液和0.15 mg/mL 酪氨酸酶溶液，充分混勻，在37 ℃水浴鍋中孵育反應30 min，然后立即測定各試管中反應溶液在475 nm 處的吸光值。上述試驗均重復3 次。

根據(jù)酶反應活性的定義，在一定的抑制劑濃度下，酶反應活性表示為ACTi，在沒有抑制劑時酶反應活性表示為ACT0，則受試樣品對酶的相對抑制率（I）可以定義為：

圖1 槲皮素（a）和Naringin DC（b）的結構Fig.1 Structure of quercetin（a）and naringin dihydroderone（b）

表2 酶活力測定中反應液的組成（μL）Table 1 The composition of the reaction fluid in the determination of enzyme activity（μL）

式中，ACTi——有抑制劑時的酶反應活性；ACT0——沒有抑制劑時的酶反應活性；A1，A2，A3，A4——1，2，3，4 號反應液的吸光值。

1.2.7 B16 黑色素瘤細胞細胞MTT 試驗 稱取50 g 重鉻酸鉀固體，以100 mL 蒸餾水100 ℃溶解（電爐加熱），快速加入900 mL 濃H2SO4，混勻，冷卻即可使用。MTT 用PBS 配制成質量濃度5 mg/mL，過0.22 μm 水相濾膜后存于10 mL 無菌離心管中，于-20 ℃冷凍保存。具體步驟：

1）取柚皮苷、Naringin DC 和熊果苷的標準品20 mg，加入DMSO 溶解配成500 mmol/L 的母液，過0.22 μm 有機濾膜后以每管20 μL 分裝于無菌的200 μL 離心管中，于-20 ℃冷凍保藏。

2）不同濃度樣品的配制 分別取柚皮苷、Naringin DC 和熊果苷3 種物質500 mmol/L 的母液各4 μL，加入4 mL 1640 基礎培養(yǎng)基中，配成500 μmol/L 的溶液，然后分別稀釋到250，125，62.5 μmol/L 3 個濃度。

3）96 孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細胞 在超凈工作臺中移取5 mL 75T 細胞培養(yǎng)瓶終止消化后的細胞與培養(yǎng)液的混合液于離心管中，800 r/min 離心4 min，棄上清液，移取3 mL 完全培養(yǎng)基于離心管并混勻細胞液，取上述1 mL 細胞液，加1 mL 完全培養(yǎng)基，取80 μL 于平板計數(shù)器計數(shù)，用完全培養(yǎng)基稀釋調整細胞濃度為8 000 個細胞/100 μL，用12 通道移液槍將細胞液混勻，加入96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL，做好標記后將細胞培養(yǎng)板放入CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

4）96 孔細胞培養(yǎng)板中加入樣品 將上述96孔細胞培養(yǎng)板放入CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用廢液真空泵吸棄細胞培養(yǎng)液，每孔加入不同濃度的樣品150 μL，并且每塊96 孔板都要留1 到2列只加基礎培養(yǎng)基做空白對照，做好標記后將細胞培養(yǎng)板放入CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

5）B16 黑色素瘤細胞的MTT 試驗 在超凈工作臺中，取PBS 配成質量濃度5 mg/mL 的MTT溶液，與基礎培養(yǎng)基以體積比1∶9 的比例配成MTT 細胞培養(yǎng)液。將步驟4）中加樣品培養(yǎng)24 h后的細胞培養(yǎng)液用廢液真空泵吸棄，每孔加入150 μL MTT 細胞培養(yǎng)液，做好標記后將細胞培養(yǎng)板放入CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，吸棄MTT 細胞培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，于酶標儀中振動10 min 后測定波長490 nm 處的吸光度值。

細胞存活率=（A0-Ax）/A0×100%

式中，A0——不加樣品的空白吸光度值；Ax——加不同濃度樣品作用后的吸光度值。

1.2.8 B16 黑色素瘤細胞Hoechst 熒光染色試驗具體操作步驟：

1）于超凈工作臺上，打開六孔板，置滅菌蓋玻片。將細胞懸液滴加至蓋玻片上，置CO2體積分數(shù)為5 %的培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)至細胞固著（約2 h），加入2 mL 細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)約6 h。棄培養(yǎng)基，用PBS 洗3 次，每次5 min。

2）用4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗3 次，每次5 min。

3）切片稍甩干后在圈內滴加適量Hoechst染液到爬片上，室溫避光孵育15 min。

4）PBS 漂洗爬片3 次，每次5 min，從六孔板內取出爬片，將有細胞的一面封到滴加有抗熒光淬滅封片劑的載玻片上，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.9 Naringin DC 與雙孢蘑菇酪氨酸酶的分子對接 采用ChemBioDraw Ultra 14.0 畫出化合物熊果苷和Naringin DC 的結構，然后用Chem-Bio3D Ultra 14.0 轉化為三維結構，用MMFF94 力場進行優(yōu)化。雙孢蘑菇酪氨酸酶的三維結構（PDB ID：2Y9X）從RCSB 蛋白數(shù)據(jù)庫下載。酪氨酸酶和化合物均使用AutodockTools 1.5.6 轉化為PDBQT 格式。采用Autodock vina 1.1.2 進行分子對接。酪氨酸酶活性位點的坐標設置為：center_x=-10.044，center_y=-28.706，center_z=-43.443；size_x=15，size_y=15，size_z=15。為了增加計算的準確度，將參數(shù)exhaustiveness 設置為20。其它參數(shù)均用默認值。最后，選取打分值最高的構象用PyMoL 1.7.6 進行結果分析。

圖2 熊果苷（a）和柚皮苷二氫査爾酮（b）的結構Fig.2 Structure of arbutin（a）and naringin dihydroderone（b）

2 結果與討論

2.1 柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及槲皮素對ABTS 自由基的清除效果

以Trolox 作為對照，以其濃度-吸光值繪制標準曲線y= 0.3627x + 0.0661（R2= 0.9943），研究柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及槲皮素4 種樣品對ABTS 自由基清除效果，結果見圖3。4 種樣品對ABTS 自由基清除效果以Trolox 的抗氧化物質的量表示，結果見表3。

由表3 可知，4 種樣品對ABTS 自由基均有清除作用。以Trolox 作為對照，4 種樣品的總抗氧化能力結果中，柚皮苷的Trolox 抗氧化物質的量為0.1748 mmoL/g，NHDC 為2.9109 mmoL/g，Naringin DC 為0.6986 mmoL/g，槲皮素為39.6103 mmoL/g。4 種樣品對ABTS 自由基清除能力依次為槲皮素＞NHDC＞Naringin DC＞柚皮苷。

2.2 柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及槲皮素對羥自由基的清除效果

以Trolox 為對照，以其濃度-吸光值繪制標準曲線y = 4.0588x + 0.079（R2= 0.9998），研究柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及槲皮素4 種樣品對羥自由基清除效果，結果見圖4。4 種樣品對羥自由基清除效果以Trolox 的抗氧化物質的量表示，結果見表4。

由表4 可看出，4 種樣品對羥自由基均有清除作用，試驗中以Trolox 作為對照，得到柚皮苷清除能力的Trolox 物質的量為19.8 μmoL/g，Naringin DC 為31.9 μmoL/g，NHDC 為44.4 μmoL/g，槲皮素為365.5 μmoL/g。4 種樣品清除羥自由基能力依次為槲皮素＞NHDC＞Naringin DC＞柚皮苷。

圖3 Trolox 清除ABTS 自由基標準曲線Fig.3 Standard curve of scavenging ABTS Trolox

圖4 Trolox 清除羥自由基標準曲線Fig.4 Standard curve of hydroxyl radical scavenging activity of Trolox

表3 4 種樣品對ABTS 自由基的清除作用Table 3 Scavenging effect of 4 samples on ABTS

表4 羥自由基清除作用Table 4 Scavenging effect of hydroxyl radicals

2.3 柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及槲皮素對鐵離子的還原作用

研究了柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及槲皮素4 種樣品對鐵離子的還原作用，以VC 為對照，以其濃度-吸光值繪制標準曲線y = 0.0006x +0.0943（R2=0.9998），4 種樣品對鐵離子的還原作用以VC 的相等還原能力時的用量表示，結果如表5所示。

由表5 可看出，4 種樣品對三價鐵離子均有還原作用。以維生素C 為對照，柚皮苷的VC 抗氧化物質的量為66.48 μmoL/g，Naringin DC 為72.67 μmoL/g，NHDC 為339.63 μmoL/g，槲皮素為32 751.11 μmoL/g。4 種樣品對鐵離子還原能力依次為槲皮素＞NHDC ＞Naringin DC ＞柚皮苷。

2.4 柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及槲皮素對氧自由基的清除效果

以Trolox 為對照，以其濃度-吸光值繪制標準曲線y=0.0398x+92.858（R2=0.99），研究柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及槲皮素4 種樣品對氧自由基的清除效果，結果見圖6。按照1.2.4 節(jié)方法統(tǒng)計樣品各濃度的AUC 值，4 種樣品對氧自由基清除效果以Trolox 的抗氧化物質的量表示，結果見表6。

由表6 可知，4 種樣品清除氧自由基作用排序為槲皮素＞Naringin DC ＞NHDC ＞柚皮苷，柚皮苷的抗氧化性遠小于2 種二氫查爾酮，說明在柚皮苷加氫過程中結構發(fā)生改變，加氫產物的抗氧化性提高。

圖5 VC 標準曲線Fig.5 Standard curve of vitamin C

圖6 Trolox 清除氧自由基標準曲線Fig.6 Standard curve of scavenging oxygen free radical of Trolox

表5 4 種樣品對鐵離子的還原作用Table 5 Reduction of iron ions of four samples

表6 樣品對氧自由基清除作用Table 6 The scavenging effect of samples on the oxygen free radical

2.5 Naringin DC 與人銅鋅超氧化物歧化酶SOD 對接結果

為了從分子水平闡明槲皮素與人銅鋅超氧化物歧化酶的作用模式，將槲皮素對接至銅鋅超氧化物歧化酶的活性口袋。槲皮素與銅鋅超氧化物歧化酶的結合模式如圖7a所示，由圖7 可以看出，槲皮素分子位于一個由氨基酸殘基A/Leu-106、A/Cys-111、A/Ile-113、A/Ile-151、B/Cys-111和B/Ile-113 組成的疏水性腔袋，形成穩(wěn)定的疏水性相互作用。詳細分析可得出：槲皮素的苯環(huán)可與氨基酸殘基B/Arg-115 形成陽離子-π 相互作用。重要的是，槲皮素的羥基可與氨基酸殘基A/Gly-108 形成長為2.7 ? 的氫鍵作用。所有這些相互作用使得槲皮素與銅鋅超氧化物歧化酶形成穩(wěn)定的復合物。

為進一步闡明Naringin DC 與銅鋅超氧化物歧化酶的結合模式，將Naringin DC 對接至銅鋅超氧化物歧化酶的活性口袋，結果如圖7b所示。Naringin DC 位于一個由氨基酸殘基A/Leu-106、A/Cys -111、A/Ile -113、A/Ile -151、A/Ile -112、B/Leu-106、B/Ala-1、B/Ile-113、B/Cys-111 和B/Ile-151 所組成的疏水性腔袋，并形成強烈的疏水性相互作用。分析可知，Naringin DC 的末端苯環(huán)可與氨基酸殘基B/Arg-115 形成陽離子-π 相互作用。重要的是，Naringin DC 可分別與氨基酸殘基A/Leu-106、A/Gly-108、A/Cys-111 形成長為2.3，2.1 ? 和2.6 ? 的三重氫鍵作用。所有這些相互作用使得Naringin DC 與銅鋅超氧化物歧化酶形成穩(wěn)定的復合物。

此外，槲皮素和Naringin DC 與人銅鋅超氧化物歧化酶的結合能分別為-28.4512 kJ/mol和-29.288 kJ/mol。此結果表明槲皮素和Naringin DC 可能為銅鋅超氧化物歧化酶的抑制劑，且Naringin DC 的活性優(yōu)于槲皮素。

總之，上述分子對接研究對化合物槲皮素和Naringin DC 與人銅鋅超氧化物歧化酶的相互作用給予合理的解釋，為從分子水平解釋其相互作用提供了新思路。

圖7 對接結果Fig.7 Docking results

2.6 柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及熊果苷對酪氨酸酶的抑制作用

柚皮苷、Naringin DC、NHDC 及熊果苷4 種樣品對酪氨酸酶的抑制作用如圖8所示。根據(jù)不同質量濃度的各樣品對酪氨酸酶的抑制率，采用對數(shù)方程擬合，得到擬合曲線如表7所示。根據(jù)擬合方程計算得到IC50值。

根據(jù)表7 可看出，4 種樣品對酪氨酸酶均有抑制作用。由柚皮苷對酪氨酸酶抑制作用的擬合曲線計算得到IC50=33.58 mg/mL；由Naringin DC擬合曲線計算得到IC50=13.22 mg/mL；由NHDC 擬合曲線計算得到IC50=13.79 mg/mL；由熊果苷擬合曲線計算得到IC50=13.09 mg/mL。比較它們的IC50可以看出：4 者對酪氨酸酶抑制能力排序為NHDC ＞熊果苷≥Naringin DC ＞柚皮苷。

2.7 Naringin DC 與雙孢蘑菇酪氨酸酶的分子對接結果

為從分子水平闡明熊果苷與雙孢蘑菇酪氨酸酶的作用模式，將熊果苷對接至酪氨酸酶的活性口袋。熊果苷與酪氨酸酶的結合模式如圖9a所示。

圖8 4 種樣品對酪氨酸酶的抑制效果Fig.8 Inhibitory effect of 4 kinds of samples on tyrosinase

表7 酪氨酸酶抑制作用的IC50 值Table 7 IC50 values of the inhibitory effect on tyrosinase

由圖9 可看出，熊果苷分子位于一個由氨基酸殘基Val-248、Phe-264、Met-280、Val-283 和Ala-286 所組成的疏水性腔袋，形成穩(wěn)定的疏水性作用。分析可知，熊果苷苯環(huán)上的4 位羥基可與氨基酸殘基His-263 形成長為2.6 ? 的氫鍵作用。所有這些相互作用使熊果苷與酪氨酸酶形成穩(wěn)定的復合物。為進一步闡明Naringin DC 與酪氨酸酶的結合模式，將Naringin DC 對接至酪氨酸酶的活性口袋，結果如圖9b所示。Naringin DC 分子位于一個由氨基酸殘基Phe-264、Pro-277、Met-280、Val-283、Pro-284 和Ala-286 所組成的疏水性腔袋，并形成強烈的疏水性作用。分析可知，Naringin DC 的末端苯環(huán)可分別與氨基酸殘基Phe-264 和His-263 形成π-π 堆積作用以及CH-π 相互作用。重要的是，Naringin DC 可分別與氨基酸殘基His-244 和Met-280 形成長為2.6 ? 和2.0? 的雙重氫鍵作用。所有這些相互作用使Naringin DC 與酪氨酸酶形成穩(wěn)定的復合物。

此外，熊果苷和Naringin DC 與雙孢蘑菇酪氨酸酶的結合能分別為-25.104 kJ/mol 和-27.6144 kJ/mol，推測熊果苷和Naringin DC 均可能為酪氨酸酶的抑制劑，且Naringin DC 的活性優(yōu)于熊果苷。

圖9 對接結果Fig.9 Docking results

圖10 MTT 試驗結果Fig.10 MTT experimental results

總之，上述分子對接研究對化合物熊果苷和Naringin DC 與雙孢蘑菇酪氨酸酶的相互作用給予合理的解釋，為從分子水平解釋其相互作用提供新思路。

2.8 小鼠黑色素瘤B16 細胞MTT 試驗結果

由圖10 可看出，Naringin DC、柚皮苷和熊果苷在500 μmol/L 及以下濃度，由B16 細胞MTT 試驗測得的細胞存活率均大于90%，說明Naringin DC、柚皮苷和熊果苷在500 μmol/L 及以下濃度是B16 細胞的安全濃度。

2.9 B16 黑色素瘤細胞Hoechst 熒光染色試驗結果

由圖11 可看出，在濃度500 μmol/L 條件，柚皮苷組、Naringin DC 組和熊果苷組與空白組對比，細胞密度與數(shù)量相近，表明細胞沒有凋亡，因此500 μmol/L 是藥物組的安全濃度。

圖11 熒光染色試驗結果Fig.11 Experimental results of fluorescence staining

3 結論

利用4 種常見的抗氧化和分子對接方法研究了柚皮苷二氫查爾酮的抗氧化活性，通過測定酪氨酸酶活性研究了其美白活性，通過MTT 試驗測定了其細胞毒性，所得結論：柚皮苷二氫查爾酮具有較好的抗氧化性和美白活性，對小鼠黑色素瘤B16 細胞的安全濃度為≤500 μmol/L。