趙丹丹，丁玉庭，陳文烜，胡 俊，周緒霞*

（1 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所 杭州310021 2 浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 杭州310014）

微生物的生長(zhǎng)繁殖和代謝是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的重要因素。細(xì)菌群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）是一種依賴于細(xì)胞密度的信息交流方式，以自誘導(dǎo)物（Autoinducers，AIs）為群體感應(yīng)信號(hào)分子，它通過(guò)調(diào)控食品中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)代謝來(lái)調(diào)控食品腐敗進(jìn)程[1]。研究表明，群體感應(yīng)抑制劑可通過(guò)與AIs 受體蛋白結(jié)合，降解AIs 分子和阻斷群體感應(yīng)通路等途徑有效干擾細(xì)菌群體感應(yīng)的表達(dá)，降低食源性細(xì)菌的致病性或致腐性[2]。利用群體感應(yīng)抑制劑靶向調(diào)控細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)來(lái)抑制食品腐敗，已成為食品保鮮領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

近年來(lái)，研究學(xué)者在水果、蔬菜和中草藥等天然植物的提取物中篩選到很多安全、有效的活性成分，這些物質(zhì)作為群體感應(yīng)抑制劑可有效降低微生物的毒性[3-5]。大蒜提取物是具有群體感應(yīng)抑制活性的物質(zhì)，能在亞抑菌濃度下阻斷N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHLs）信號(hào)分子介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)，抑制其毒力因子產(chǎn)生[6-9]，然而，目前關(guān)于大蒜提取物對(duì)腐敗菌腐敗能力的干擾作用仍少有報(bào)道。

本試驗(yàn)以在發(fā)酵魚(yú)糜中篩選到的腐敗菌維氏氣單胞菌為對(duì)象，分析其AHLs 介導(dǎo)的群體感應(yīng)現(xiàn)象，探究大蒜提取物對(duì)該細(xì)菌產(chǎn)AHLs 活性、生物膜形成能力、毒力基因表達(dá)和致腐能力的干擾作用，以期利用大蒜提取物等群體感應(yīng)抑制劑作為食品保鮮劑，提高食品的安全性和貨架期。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：新鮮大蒜，購(gòu)于杭州市潮王路菜市場(chǎng)；魚(yú)糜，A 級(jí)海產(chǎn)銅盆魚(yú)糜，由上虞市傣之味食品有限公司提供，貯藏于-18 ℃冰箱中，備用。

菌種：維氏氣單胞菌，分離于發(fā)酵魚(yú)糜，添加20%甘油，保存于本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱中。根癌農(nóng)桿菌【Agrobacterium tumefaeiens A136（pCF218/PCF372）】，壯觀霉素抗性，用量為50 μg/mL。

試劑：甲酸、乙酸乙酯、二甲基亞砜（DMSO）、甲苯為分析純級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、結(jié)晶紫、吖啶橙、壯觀霉素、細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、細(xì)菌總RNA 快速抽提試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；RP-C18 F254s 反相薄層層析板，德國(guó)Merck 公司；AHLs 標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M5 酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices 公司；LifeEco PCR 儀，杭州博日科技有限公司；FV300 激光共聚焦顯微鏡，日本OLYMPUS 公司；StepOne 型熒光定量PCR 儀，美國(guó)ABI 公司；PHS-3C 型數(shù)顯酸度計(jì)，上海精科儀器有限公司；K9840 自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；e2695 型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters 公司；YXQ-LS-SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌產(chǎn)AHLs 分子檢測(cè) 參照Ravn 等[10]的方法，采用生物報(bào)告菌法分析細(xì)菌產(chǎn)AHLs 分子的活性和種類。

采用平行劃線法分析AHLs 的產(chǎn)生情況，在含1%瓊脂的LB 平板上涂布40 μL X-gal（20 mg/mL），將活化12 h 的根癌農(nóng)桿菌與待測(cè)菌平行劃線，于30 ℃中培養(yǎng)24 h，觀察根癌農(nóng)桿菌的顏色變化。

將待測(cè)菌培養(yǎng)液離心（8 000×g，5 min，4 ℃），上清液用等量酸化乙酸乙酯（0.5%甲酸）提取2～3次，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，用DMSO重新溶解，于-20 ℃保存待用。

采用平板擴(kuò)散法分析AHLs 活性變化，100 mL 含1%瓊脂的LB 培養(yǎng)基中加入4～10 mL 活化的根癌農(nóng)桿菌和500 μL X-gal（20 mg/mL），混合均勻后傾注平板，待冷卻凝固后打孔，加入40 μL待測(cè)菌AHLs 提取液，于30 ℃中培養(yǎng)36～48 h，觀察平板的顏色變化。

采用薄層色譜法（TLC）分析細(xì)菌產(chǎn)生AHLs種類，取1～10 μL AHLs 標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)菌AHLs 提取物樣品，點(diǎn)樣于C18 反相薄層層析板。用層析液甲醇-水（體積比60/40）充分展開(kāi)，取出后在常溫下?lián)]干溶劑。制備含根癌農(nóng)桿菌的固體培養(yǎng)基，傾于板上，凝固后在30℃無(wú)菌密閉容器中培養(yǎng)36～48 h，觀察顏色變化。AHLs 標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為：0.1 mmol/L N-丁酰基-高絲氨酸內(nèi)酯（C4-HSL）、10 μmol/L N-己?；?高絲氨酸內(nèi)酯（C6-HSL）、0.04 μmol/L N-庚?；?高絲氨酸內(nèi)酯（C7-HSL）、0.06 μmol/L N-辛?；?高絲氨酸內(nèi)酯（C8-HSL）、0.8 nmol/L 3-氧代-己?；?高絲氨酸內(nèi)酯（oxo-C6-HSL）和1.6 nmol/L 3-氧代-辛酰基-高絲氨酸內(nèi)酯（oxo-C8-HSL）。

1.3.2 細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線及培養(yǎng)液pH 值的測(cè)定將活化12 h 的待測(cè)菌接種到100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，在30 ℃下?lián)u床培養(yǎng)24 h，間隔一定時(shí)間取樣，參照GB/T 4789.2-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》計(jì)數(shù)，同時(shí)利用酸度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液pH 值的變化。

1.3.3 基因分析 采用PCR 技術(shù)分析細(xì)菌的luxRI 同源基因、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶基因（ODC）、賴氨酸脫羧酶基因（LDC）、鞭毛基因（fla）、彈性蛋白酶（ahyB）、絲氨酸蛋白酶基因（ser）、脂肪酶基因（lip）。將細(xì)菌過(guò)夜活化，利用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取細(xì)菌DNA 模板，使用的引物見(jiàn)表1。50 μL反應(yīng)體系，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃3 min，變性95 ℃30 s，退火55 ℃1 min，延伸72 ℃1 min（35 個(gè)循環(huán)），終延伸72 ℃10 min。其中，擴(kuò)增ahyB 和fla 基因時(shí)退火溫度為59 ℃。將擴(kuò)增到的基因片段進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下成像，同時(shí)送往生工生物工程有限公司測(cè)序。將得到的序列進(jìn)行BLAST 搜索和同源性分析。

表1 PCR 所使用的引物序列Table 1 Primers used for PCR

1.3.4 大蒜提取物的制備 參照Rasmussen 等[6]的方法制備大蒜提取物。將市售大蒜去皮，稱取150 g 于300 mL 甲苯中勻漿，萃取12 h 后用Whatman 1 號(hào)濾紙過(guò)濾。向?yàn)V液中加入150 mL 無(wú)菌水，在室溫條件下攪拌24 h，兩相分離得水相，經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾后得1 g/mL 大蒜提取物。通過(guò)二倍稀釋法確定大蒜提取物對(duì)待測(cè)菌的最小抑菌濃度。

1.3.5 β-半乳糖酶活性的測(cè)定 將待測(cè)菌過(guò)夜活化12 h，取500 μL 細(xì)菌培養(yǎng)液接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，分別加入1 mL 不同質(zhì)量濃度的大蒜提取物（終質(zhì)量濃度為0.15～1.20 mg/mL），以無(wú)菌生理鹽水為對(duì)照，于30 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)12 h，將培養(yǎng)液離心（8 000×g，10 min）得上清液。參照Miller[11]的方法測(cè)定生物報(bào)告菌的β-半乳糖酶活性。

1.3.6 生物膜形成能力的測(cè)定 參照Kusada等[12]的方法，采用結(jié)晶紫染色法分析大蒜提取物對(duì)細(xì)菌生物膜形成能力的影響。將細(xì)菌培養(yǎng)液按1∶1 000 的比例稀釋，加入無(wú)菌96 孔板中，加入不同濃度的大蒜提取物（終質(zhì)量濃度為 0.15～1.20 mg/mL），30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。移除培養(yǎng)液，用無(wú)菌去離子水沖洗3 次，無(wú)菌風(fēng)干燥，加入200 μL 0.1%結(jié)晶紫染色液，室溫染色15 min，無(wú)菌水沖洗3 次，加入1 mL 95%乙醇漂洗生物膜，將洗液于波長(zhǎng)570 nm 處測(cè)定OD 值。

參照Packiavathy 等[13]的方法，利用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）分析細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)的變化。將細(xì)菌培養(yǎng)液按1%的比例接入含1 mL LB 培養(yǎng)基的24 孔板中，加入1.20 mg/mL 大蒜提取物和直徑為1 cm 的圓形蓋玻片，靜置培養(yǎng)24 h。用無(wú)菌水輕輕沖洗玻片上未粘附的細(xì)胞，0.1%吖啶橙染色1 min。洗去多余的染色液，將蓋玻片置顯微鏡下觀察。該顯微鏡裝有激發(fā)波長(zhǎng)為515～560 nm 的激發(fā)濾光器及60×（60 倍）的油鏡，其熒光顯微鏡照片與光鏡照片均由Fluoview v5.0 軟件獲得。

1.3.7 基因表達(dá)量的測(cè)定 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)。細(xì)菌活化后加入1.20 mg/mL大蒜提取物培養(yǎng)24 h，利用細(xì)菌RNA 提取試劑盒提取細(xì)菌RNA。在20 μL 反應(yīng)體系中，加入10 μL 2×熒光定量PCR 預(yù)混體系，0.4 μL 10 μmol/L上、下游引物，2 μL cDNA 模板。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃3 min，變性95 ℃7 s，退火57 ℃10 s，延伸72 ℃15 s（45 個(gè)循環(huán)）。相對(duì)表達(dá)量（RQ）由2-ΔΔct方法計(jì)算得出。

表2 RT-PCR 所使用的引物序列Table 2 Primers used for RT-PCR in this study

1.3.8 細(xì)菌腐敗能力的測(cè)定 參照Z(yǔ)hao 等[14]的方法制備無(wú)菌魚(yú)糜肉汁。冷凍魚(yú)糜解凍后，按質(zhì)量比1∶1 加水打漿，加熱煮沸5 min 后靜置，冷卻至室溫。用2 層紗布過(guò)濾得魚(yú)糜肉汁，加入1.6 g/L氧化三甲胺、40 mg/L L-半胱氨酸和40 mg/L L-甲硫氨酸，混合均勻后于121 ℃高壓滅菌15 min，得無(wú)菌魚(yú)糜肉汁。無(wú)菌條件下，在魚(yú)糜肉汁中添加不同質(zhì)量濃度的大蒜提取物（終質(zhì)量濃度為0.15～1.20 mg/mL）。將制備好的細(xì)菌菌懸液接種至無(wú)菌魚(yú)糜肉汁中，于30 ℃中搖床培養(yǎng)48 h，每間隔6 h取樣，測(cè)定魚(yú)糜肉汁中TVB-N 和腐胺含量變化。

TVB-N 的測(cè)定參照趙丹丹等[15]的方法，取5 mL 樣品，加入15 mL 0.6 mol/L 高氯酸溶液均質(zhì)混勻，上清液用半自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定。腐胺含量的測(cè)定參照Z(yǔ)hao 等[14]的方法，取2 mL 樣品，加入25 mL 0.4 mol/L 高氯酸溶液均質(zhì)混勻，上清液用丹磺酰氯衍生后用高效液相色譜分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 21.0 軟件和Origin 8.5 軟件分析數(shù)據(jù)。測(cè)定結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n ≥3）表示，采用最小顯著差異法（LSD）進(jìn)行顯著性差異分析，顯著性水平為5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 維氏氣單胞菌產(chǎn)AHLs 信號(hào)分子的種類

以根癌農(nóng)桿菌為報(bào)告菌，利用平行劃線法分析維氏氣單胞菌的AHLs 分子產(chǎn)生情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。細(xì)菌產(chǎn)生的AHLs 可通過(guò)瓊脂擴(kuò)散誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，并分解底物X-gal產(chǎn)生藍(lán)色色素。由圖1 可知，維氏氣單胞菌可產(chǎn)生AHLs 類信號(hào)分子并誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌顯藍(lán)色。

根癌農(nóng)桿菌對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度或帶有不同基團(tuán)的AHLs 分子敏感程度不同，這些AHLs 經(jīng)TLC 展開(kāi)，在培養(yǎng)基相應(yīng)的位置誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌呈現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)。根據(jù)斑點(diǎn)的比移值、形狀和顏色深、淺可直觀判斷AHLs 的種類及相對(duì)含量。對(duì)維氏氣單胞菌的AHLs 提取液的TLC 分析結(jié)果見(jiàn)圖2。分析可知，該細(xì)菌至少產(chǎn)生3 種AHLs 分子，即：C6-HSL、C7-HSL 和C8-HSL。C4-HSL 與C6-HSL 是目前氣單胞菌屬報(bào)道最多的2 種AHLs 信號(hào)分子[16]。Li 等[17]在腐敗比目魚(yú)中分離的溫和氣單胞菌中檢測(cè)到C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、N-癸?；?高絲氨酸內(nèi)酯（C10-HSL）和N-十二?；?高絲氨酸內(nèi)酯（C12-HSL）。本試驗(yàn)在維氏氣單胞菌中檢測(cè)到側(cè)鏈上的碳原子數(shù)目為奇數(shù)的AHL 信號(hào)分子，即C7-HSL。

2.2 維氏氣單胞菌生長(zhǎng)過(guò)程中AHLs 活性變化

細(xì)菌產(chǎn)生的AHLs 分子濃度受細(xì)菌密度變化影響，不同生長(zhǎng)階段的細(xì)菌AHLs 提取液能誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌產(chǎn)生不同直徑的藍(lán)色圈。維氏氣單胞菌生長(zhǎng)過(guò)程中的細(xì)菌總數(shù)與培養(yǎng)液pH 值的變化見(jiàn)圖3，AHLs 活性變化見(jiàn)圖4。分析可知，細(xì)菌培養(yǎng)4 h 時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期，此時(shí)細(xì)菌分泌的AHLs 可誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌顯藍(lán)色。在4～10 h 細(xì)菌的快速生長(zhǎng)階段，根癌農(nóng)桿菌的變色直徑不斷增大，說(shuō)明AHLs 的含量快速累積。在10～18 h 時(shí)，根癌農(nóng)桿菌藍(lán)色圈的直徑最大，此時(shí)培養(yǎng)液中AHLs 濃度最高。在18～48 h，細(xì)菌處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期，誘導(dǎo)報(bào)告菌變色的直徑減小，說(shuō)明AHLs 的濃度開(kāi)始降低。研究發(fā)現(xiàn)，AHLs 含量的減少與環(huán)境pH 值升高有關(guān)[18]。AHLs 的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)在堿性條件下結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易解環(huán)[19]。對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液的pH 值變化的分析表明：細(xì)菌培養(yǎng)18 h 后培養(yǎng)液的pH 值由6.92 增至8.11，培養(yǎng)48 h時(shí)pH 值達(dá)8.97。隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，培養(yǎng)液的pH值不斷升高，AHLs 開(kāi)始降解，活性降低。

圖1 利用根癌農(nóng)桿菌分析維氏氣單胞菌的AHLs 產(chǎn)生情況Fig.1 Detection of AHLs production of A.veronii bv.veronii using A.tumefaeiens A136

圖2 維氏氣單胞菌產(chǎn)AHLs 的種類Fig.2 The types of AHLs produced in A.veronii bv.veronii

圖3 維氏氣單胞菌生長(zhǎng)過(guò)程中的細(xì)菌總數(shù)與pH 值的變化Fig.3 The changes in growth number and pH values of A.veronii bv.veronii during growth

圖4 維氏氣單胞菌在生長(zhǎng)過(guò)程中AHLs 的活性變化Fig.4 The changes in AHLs activities of A.veronii bv.veronii during growth

2.3 維氏氣單胞菌的基因分析

革蘭氏陰性菌AHLs 介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)主要由luxRI 的同源基因調(diào)控[20]。利用PCR 技術(shù)分析維氏氣單胞菌中的luxRI 同源基因，結(jié)果見(jiàn)圖5a。分析發(fā)現(xiàn)2 個(gè)片段序列分別為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子acuR 和自誘導(dǎo)基因acuI，這與Jangid 等[21]的研究結(jié)果相同，該學(xué)者首次在維氏氣單胞菌MTCC 3249 中檢測(cè)到acuRI 群體感應(yīng)系統(tǒng)。此外，分析維氏氣單胞菌的氨基酸脫羧酶基因和毒力基因，結(jié)果見(jiàn)圖5b、5c。鳥(niǎo)氨酸脫羧酶基因（ODC）和賴氨酸脫羧酶基因（LDC）的檢出說(shuō)明該細(xì)菌具有產(chǎn)腐胺和尸胺的能力，胞外酶基因（ahyB，ser，lip）的檢出說(shuō)明該菌具有一定的蛋白酶活性和脂肪酶活性，鞭毛基因（fla）的檢出說(shuō)明該菌具有鞭毛運(yùn)動(dòng)和形成生物膜的能力。

圖5 維氏氣單胞菌基因的PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Agarose gel electrophoresis of PCR products of genes in A.veronii bv.veronii

2.4 大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌產(chǎn)AHLs 的抑制作用

大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL（數(shù)據(jù)未顯示）。本試驗(yàn)選擇低于此質(zhì)量濃度的系列（0，0.15，0.3，0.6，1.2 mg/mL）來(lái)研究大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌群體感應(yīng)的干擾作用。

通過(guò)檢測(cè)生物報(bào)告菌根癌農(nóng)桿菌的β-半乳糖苷酶活性來(lái)分析不同濃度大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌產(chǎn)生AHLs 活性的干擾作用，結(jié)果見(jiàn)圖6。分析可知，隨著大蒜提取物質(zhì)量濃度的增加（0～1.20 mg/mL），根癌農(nóng)桿菌的β-半乳糖苷酶活性不斷降低（P＜0.05）。這說(shuō)明大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌產(chǎn)AHLs 活性具有顯著的抑制作用（P＜0.05），且大蒜提取物的質(zhì)量濃度與其群體感應(yīng)抑制活性呈明顯量效關(guān)系。大蒜提取物質(zhì)量濃度為1.20 mg/mL 時(shí)對(duì)根癌農(nóng)桿菌的β-半乳糖苷酶活性的抑制率最高，為39.6%。這可能是因?yàn)榇速|(zhì)量濃度下維氏氣單胞菌AcuR 蛋白與群體感應(yīng)抑制活性物質(zhì)的結(jié)合力最強(qiáng)，抑制了AHLs 分子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[22]。

2.5 大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌生物膜形成能力的干擾作用

氣單胞菌屬的成膜能力是受群體感應(yīng)調(diào)控的。通過(guò)結(jié)晶紫染色法和CLSM 技術(shù)分析大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌生物膜形成能力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7、圖8。分析可知，大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌的生物膜形成有顯著的抑制作用（P＜0.05），且大蒜提取物的質(zhì)量濃度與其抑制活性呈量效關(guān)系。與對(duì)照組相比，在1.20 mg/mL 大蒜提取物的作用下，細(xì)菌培養(yǎng)24 h 后形成的生物膜量顯著降低36.7%（P＜0.05）。通過(guò)分析維氏氣單胞菌成膜結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)1.20 mg/mL 大蒜提取物處理，該細(xì)菌形成的生物膜細(xì)胞密度明顯減小，結(jié)構(gòu)較為疏松。Li 等[9]發(fā)現(xiàn)大蒜精油中的群體感應(yīng)活性物質(zhì)能有效抑制銅綠假單胞菌的生物膜產(chǎn)生及膜中的細(xì)菌數(shù)量。Bjarnsholt 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，大蒜提取物處理后銅綠假單胞菌形成的生物膜對(duì)抗生素的耐受性大大降低。利用群體感應(yīng)抑制劑干擾食源性腐敗菌或病原菌的生物膜形成，可降低微生物污染，提高食品加工的安全性。

2.6 大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌基因表達(dá)量的影響

利用RT-PCR 技術(shù)分析大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌基因表達(dá)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖9。與對(duì)照組相比，經(jīng)1.20 mg/mL 的蒜提取物處理，acuR、acuI、ODC、fla、ahyB、ser 的基因表達(dá)量均顯著下調(diào)（P＜0.05），LDC 和lip 的基因表達(dá)量沒(méi)有顯著性變化（P＞0.05）。其中，acuR 和acuI 基因的表達(dá)量分別減少32.8%和34.6%，說(shuō)明維氏氣單胞菌的AHLs群體感應(yīng)表達(dá)受到抑制。ODC 基因表達(dá)量的下調(diào)說(shuō)明該菌產(chǎn)腐胺的能力受到一定程度的抑制。ahyR 和ser 基因表達(dá)量的下調(diào)，說(shuō)明維氏氣單胞菌胞外蛋白酶活性受到抑制。Rasmussen 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)20 mg/mL 大蒜提取物處理，銅綠假單胞菌的彈性蛋白酶基因的表達(dá)量下調(diào)10 倍。此外，維氏氣單胞菌經(jīng)1.20 mg/mL 大蒜提取物處理，鞭毛基因fla 的表達(dá)量下調(diào)37.2%。Myszka 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)干擾細(xì)菌群體感應(yīng)并抑制鞭毛基因表達(dá)，能顯著降低細(xì)菌在不銹鋼表面的聚集程度和成膜能力。

圖6 不同質(zhì)量濃度大蒜提取物對(duì)β-半乳糖苷酶活性的影響Fig.6 The effects of garlic extracts of different mass concentrations on β-galactosidase assay

圖7 不同質(zhì)量濃度大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌成膜能力的影響Fig.7 The effects of garlic extract at different mass concentrations on biofilm formation in A.veronii bv.veronii

圖8 1.20 mg/mL 大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌生物膜結(jié)構(gòu)影響的CLSM 圖Fig.8 The CLSM images of biofilm structure of A.veronii bv.veronii grown in the absence of 1.20 mg/mL garlic extract

圖9 1.20 mg/mL 大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌基因表達(dá)量的影響Fig.9 The effects of 1.20 mg/mL garlic extract on gene expression in A.veronii bv.veronii

2.7 大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌腐敗能力的干擾作用

腐敗菌產(chǎn)TVB-N 的能力與其分泌的胞外蛋白酶活力有關(guān)。細(xì)菌的蛋白酶活力越高，產(chǎn)TVBN 能力越強(qiáng)。大蒜提取物對(duì)接種維氏氣單胞菌的魚(yú)糜肉汁TVB-N 含量的影響見(jiàn)圖10?？梢?jiàn)，大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌產(chǎn)生TVB-N 的能力具有一定抑制作用，且呈明顯的量效關(guān)系，其中1.20 mg/mL 大蒜提取物對(duì)細(xì)菌產(chǎn)TVB-N 的抑制作用最為顯著（P＜0.05）。培養(yǎng)36 h 后，含1.20 mg/mL大蒜提取物的魚(yú)糜肉汁的TVB-N 含量為24.06 mg/100 mL，而對(duì)照組中TVB-N 含量為28.56 mg/100 mL，即經(jīng)1.20 mg/mL 大蒜提取物處理，魚(yú)糜肉汁中TVB-N 的含量降低15.8%。這可能與維氏氣單胞菌的胞外蛋白酶基因表達(dá)受到抑制有關(guān)。

維氏氣單胞菌產(chǎn)腐胺的能力與其分泌的鳥(niǎo)氨酸蛋白酶活力有關(guān)，酶活力越高，細(xì)菌產(chǎn)腐胺的能力越強(qiáng)。大蒜提取物對(duì)接種維氏氣單胞菌的魚(yú)糜肉汁腐胺含量的影響見(jiàn)圖11?？梢?jiàn)，大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌在魚(yú)糜肉汁中產(chǎn)腐胺的能力具有一定抑制作用。培養(yǎng)36 h 后，對(duì)照組的腐胺含量為144.03 μg/mL，1.20 mg/mL 大蒜提取物處理組的魚(yú)糜肉汁腐胺含量為118.51 μg/mL，降低17.7%。這可能是因?yàn)榇笏馓崛∥锔蓴_維氏氣單胞菌的鳥(niǎo)氨酸脫羧酶基因的表達(dá)，抑制其鳥(niǎo)氨酸蛋白酶活性。

群體感應(yīng)抑制劑可有效降低食源性腐敗菌的毒性和致腐能力，通過(guò)該抑制劑干擾腐敗菌的群體感應(yīng)表達(dá)是防止食品腐敗的有效途徑。Vittal[24]研究了咖喱樹(shù)葉精油對(duì)腐敗菌假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的干擾作用，發(fā)現(xiàn)在亞抑菌濃度范圍，該精油能夠延緩冷藏牛奶的腐敗現(xiàn)象。Li 等[25]發(fā)現(xiàn)0.1 μL/mL 肉桂醛可干擾腐敗菌的群體感應(yīng)表達(dá)并延長(zhǎng)比目魚(yú)片的冷藏貨架期。Gui 等[26]發(fā)現(xiàn)6.6 U/mL AHL 內(nèi)酯酶能降低維氏氣單胞菌的蛋白酶活力，延長(zhǎng)冷凍鱘魚(yú)的貨架期。本研究中，大蒜提取物使維氏氣單胞菌的胞外蛋白酶及氨基酸脫羧酶的基因表達(dá)下調(diào)，減少魚(yú)糜肉汁中TVB-N 和腐胺含量的累積，說(shuō)明大蒜提取物通過(guò)干擾維氏氣單胞菌的群體感應(yīng)表達(dá)降低其腐敗能力，延緩魚(yú)糜制品的腐敗。

圖10 1.20 mg/mL 大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌產(chǎn)TVB-N 能力的影響Fig.10 The effects of 1.20 mg/mL garlic extract on the production of TVB-N in A.veronii bv.veronii

圖11 1.20 mg/mL 大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌產(chǎn)腐胺能力的影響Fig.11 The effects of 1.20 mg/mL garlic extract on the production of putrescine in A.veronii bv.eronii

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵魚(yú)糜中分離的維氏氣單胞菌具有AHLs 介導(dǎo)的群體感應(yīng)現(xiàn)象，可產(chǎn)生C6-HSL、C7-HSL 和C8-HSL，且AHLs 分子活性受細(xì)菌生長(zhǎng)密度和培養(yǎng)液pH 值的影響呈先增加后降低的趨勢(shì)。大蒜提取物對(duì)維氏氣單胞菌的AHLs活性、成膜能力、群體感應(yīng)調(diào)控基因表達(dá)及腐敗能力的影響是：通過(guò)干擾細(xì)菌AHLs 介導(dǎo)的群體感應(yīng)表達(dá)，降低細(xì)菌的毒性和腐敗能力。在今后的研究中，可對(duì)大蒜提取物進(jìn)行分離純化，研究其活性成分對(duì)魚(yú)糜制品腐敗變質(zhì)的調(diào)控作用。