張 舒，李 然，徐先知，黃元宏，夏安周

徐州醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，徐州 221004

急性腎損傷（acute kidney diseases，AKI）是臨床常見的急危重癥，具有較高發(fā)病率和死亡率，并可能參與慢性腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展[1]。腎缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是引起AKI 最常見的原因，在臨床上常見于休克后微循環(huán)再通、腎移植、彌散性血管內(nèi)凝血等[2]手術(shù)過程中，嚴重時可引起急性腎功能衰竭。因此，如何減輕腎缺血再灌注損傷一直是腎臟病領(lǐng)域的研究熱點。

缺血后處理（ischemic postconditioning，IPostC）是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要內(nèi)源性保護機制，即長時間缺血后再灌注前短時間內(nèi)反復(fù)短暫再缺血處理，可明顯減輕缺血組織的缺血-再灌注損傷。多項研究已經(jīng)證實，腎IPostC 對腎臟缺血再灌損傷具有明顯的保護作用[3]，但其確切機制仍不十分清楚。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（bone morphorgenetic protein-7，BMP-7）在腎臟發(fā)育以及急、慢性腎臟損傷修復(fù)過程中起著重要的作用[4]。Smads 蛋白家族是BMP 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的胞漿遞質(zhì)，有研究表明，BMP-7 的腎保護作用與激活Smad1/5/8 信號通路密切相關(guān)[5]。子宮敏感性相關(guān)基因-1（uterine sensitization associated gene-1，USAG-1）是腎臟中表達豐富的BMP-7 拮抗劑，有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，USAG-1 與許多腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后密切相關(guān)[6]。

本研究采用大鼠腎IRI 模型，觀察腎IPostC 時腎組織中BMP-7/Smad1/5/8 信號通路活性以及BMP-7 拮抗劑USAG-1 表達的變化，初步探討B(tài)MP-7/Smad1/5/8 信號通路在腎IPostC 減輕腎缺血再灌注損傷中的作用，為臨床腎缺血再灌注損傷的防治提供理論基礎(chǔ)和治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重200～250 g，購自山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SCXK（魯）2018 0003。

1.1.2 試劑 血肌酐（SCr）試劑盒（CO11-1）和尿素氮（BUN）試劑盒（CO13-2）購自南京建成生物有限公司；BMP-7 多克隆抗體（ab56023）和USAG-1 多克隆抗體（ab99340）購自英國ABCAM 公司；p-Smad1/5/8 單克隆抗體（13820P）購自美國CST 公司；GAPDH 單克隆抗體（TA-08）購自北京中杉生物技術(shù)有限公司；山羊抗小鼠熒光二抗（V926-32210）和山羊抗兔熒光二抗（V926-32211）購自微科曼得生物工程有限公司；TUNEL 試劑盒（一步法）（C1008）購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 SD 大鼠隨機分為假手術(shù)組（sham組）；缺血再灌注損傷組（IR 組）；缺血后處理組（IPostC 組）。每組又按再灌注不同時間分成再灌注1.5、3、6、12、24 h 共五個時間點亞組。每組6 只大鼠。

1.2.2 動物模型的制備及取材 sham 組大鼠稱重后腹腔注射10%水合氯醛麻醉（0.3～0.35 mL/100 g），麻醉后俯臥位固定于手術(shù)臺架上，于大鼠左側(cè)肋腰點下行縱向切口，充分暴露左側(cè)腎臟，使用玻璃分針分離左側(cè)腎臟腎蒂，60 min 后關(guān)腹縫合。IR 組手術(shù)方法基本同sham 組，分離左側(cè)腎臟腎蒂后，夾閉左側(cè)腎蒂60 min，然后松開動脈夾，制備腎臟缺血再灌注損傷模型。IPostC 組操作同IR 組，恢復(fù)灌注前給予6 個循環(huán)10 s 再灌注/10 s 缺血處理，然后恢復(fù)灌注。動物處死前腹主動脈采血3 mL，上下輕輕顛倒混勻3～5 次，4 ℃下3000 r·min-1離心15 min，吸取血清并分裝，-80 ℃保存。動物處死取左腎，然后沿冠狀面將其切成背、腹兩個部分，腹面腎分裝于凍存管，-80 ℃凍存?zhèn)溆茫ㄓ糜赪estern Blot），背側(cè)面置于4%的多聚甲醛固定24 h 以上，后依次進行脫水、透明、浸蠟，制成石蠟包塊，制備腎組織切片。

1.2.3 腎功能的測定 分別采用苦味酸比色法和脲酶-波氏顯色法測定大鼠SCr 和BUN 水平，檢測步驟按試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 細胞凋亡檢測 切片依次在二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各脫蠟5～10 min，分別加100%、95%、80%、70%乙醇各5 min，純水2 min；滴加20 μg·mL-1不含DNase 的蛋白酶K，20 ℃～37 ℃反應(yīng)15～30 min；PBS沖洗10 min×2 次；加免疫染色強力通透液（P0097），室溫孵育5 min；PBS 沖洗10 min×2 次；在每個樣品上加入50 μL 含TdT 酶、熒光標(biāo)記液的TUNEL 檢測液，37℃避光孵育60 min；PBS 沖洗10 min×2 次；DAPI 染色1 min；PBS 沖洗10 min×2 次；用抗熒光淬滅劑封片后于熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡。細胞核呈亮綠色熒光即陽性細胞，每個樣本觀察5 個互不重疊的高倍鏡視野，凋亡細胞核數(shù)與總細胞核數(shù)之比即為腎小管上皮細胞凋亡指數(shù)（AI）。

1.2.5 蛋白免疫印跡檢測 BMP-7、USAG-1、Smad1/5/8 蛋白表達按照RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1 的比例配制裂解液，按照裂解液（mL）∶組織重量（mg）=10∶1 的比例作冰浴勻漿；冰上裂解30 min后12000×g、4 ℃下離心15 min；吸取上清液至離心管中，并用BCA 蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度；在測完濃度的蛋白樣本中加入上樣緩沖液×5，于沸水中變性5～10 min；取樣品蛋白（60～80 μg）在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，半干轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜后用3%BSA 封閉液于搖床上搖動2 h，加入BMP-7（1∶1000）、USAG-1（1∶1000）或p-Smad1/5/8（1∶1000）一抗，置于4 ℃搖床中過夜；第二天室溫平衡30 min 后，Washing buffer 洗滌5 min×3 次，加入山羊抗兔IgG，稀釋比例為1∶10000，避光下室溫孵育2 h 后，Washing buffer 避光洗滌5 min×3 次，最后一次用PBS 避光洗膜，以去除殘留的吐溫；用濾紙吸干NC 膜上殘留液體，激光成像系統(tǒng)掃描NC膜，將所得條帶圖像用Image J 軟件進行灰度分析。以BMP-7、USAG-1、p-Smad1/5/8 與GAPDH 光密度的比值表示目的蛋白相對表達含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件作數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，數(shù)據(jù)符合方差齊性的采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多組間比較LSD 檢驗；若數(shù)據(jù)不符合方差齊性，則采用Dunnett’s T3 檢驗。假設(shè)檢驗水準(zhǔn)按α=0.05 判定。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎IPostC 對大鼠SCr 和BUN 含量影響

與sham 組相比，IR 組各時間點SCr 和BUN 的水平均明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與IR 組各對應(yīng)時間點相比，IPostC 組SCr 和BUN 的水平均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2.2 腎IPostC 對腎組織BMP-7 和USAG-1 蛋白表達的影響

圖1 各時間點大鼠SCr（A）和BUN（B）比較（，n=6）

免疫印跡檢測結(jié)果見圖2。sham 組BMP-7 蛋白高表達；IR 組各時間點BMP-7 蛋白表達量均低于sham 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且表達水平隨再灌注時間延長而逐漸下降，再灌注6 h 水平最低，隨后逐漸升高，再灌注24 h 仍低于sham 組水平；與IR 組對應(yīng)時間點相比，IPostC 組各時間點BMP-7 表達均顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且呈現(xiàn)先升高后逐漸降低的雙向變化趨勢，其中3h 時間點升高最明顯（圖2A、B）。sham 組有少量USAG-1 蛋白表達；與sham 組相比，IR 組再灌注各時間點USAG-1 蛋白表達水平均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且隨再灌注時間延長，其表達水平逐漸升高，再灌注6 h 達到高峰，隨后逐漸降低，再灌注24 h 仍明顯高于sham 組；與IR 組對應(yīng)時間點相比，IPostC 組USAG-1 表達均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2C、D。

2.3 腎IPostC 對腎組織p-Smad1/5/8 蛋白表達的影響

免疫印跡檢測結(jié)果見圖3。與sham 組相比，IR組24 h 時間點p-Smad1/5/8 蛋白表達有所下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與IR 組相比，IPostC組p-Smad1/5/8 蛋白表達明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 腎IPostC 對細胞凋亡的影響

sham 組腎組織中僅見個別腎小管上皮細胞凋亡；與sham 組相比，IR 組再灌注12 h、24 h 腎小管上皮細胞的凋亡較多，AI 增高（P<0.05）；與IR 組對應(yīng)時間點相比，IPostC 組腎小管上皮細胞凋亡明顯減少，AI 較低。結(jié)果見圖4A、B。Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，p-Smad1/5/8 和凋亡指數(shù)AI 存在顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r 為-0.855（P<0.05，見圖4C）。

3 討論

圖2 腎IPostC 對大鼠腎組織BMP-7 和USAG-1 蛋白表達的影響（，n=3）

圖3 腎IPostC 對腎組織p-Smad1/5/8 蛋白表達的影響（，n=3）

圖4 腎IPostC 對細胞凋亡的影響（，n=3）

腎擠壓傷、腎實質(zhì)切開取石、腎腫瘤行部分腎切除術(shù)和腎臟移植等手術(shù)時，均可能發(fā)生IRI[2]，嚴重時可導(dǎo)致急性腎功能衰竭。IPostC 對腎臟IRI 有一定的保護作用，但確切機制尚不清楚。因而建立理想的實驗動物模型是研究腎IRI 發(fā)生機制以及IPostC 產(chǎn)生保護作用機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實驗結(jié)果顯示，腎缺血60 min 后給予大鼠6 個循環(huán)10 s 再灌注/10 s 缺血處理，大鼠SCr 和BUN 的水平明顯降低，進一步證實IPostC 可以有效地改善腎功能。對此解析腎IPostC 減輕腎IRI 似有如下原由：

BMP-7 是TGF-β1 超家族成員之一，在多種急、慢性腎臟疾病模型中，均發(fā)現(xiàn)腎組織中BMP-7及其受體的表達明顯下調(diào)，且隨著疾病進程而加重，當(dāng)腎損傷恢復(fù)時BMP-7 的表達水平可以恢復(fù)到基準(zhǔn)線水平[7]。當(dāng)給予外源性BMP-7 則能減輕急、慢性腎損傷，加速腎功能的恢復(fù)和受損組織的修復(fù)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，IPostC 能明顯提高了大鼠腎IRI 后腎組織BMP-7 蛋白表達，其中以再灌注3 h 和6 h 升高最為明顯。故推測腎IPostC 可通過上調(diào)腎組織BMP-7 蛋白的表達而發(fā)揮其內(nèi)源性保護作用。

近年來有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性BMP-7 的活性不僅受其自身表達的影響，也受其拮抗劑的調(diào)節(jié)。另有研究發(fā)現(xiàn)，USAG-1 是大鼠腎中表達最豐富的BMP-7 特異性拮抗劑[7]。本實驗顯示，與BMP-7 變化趨勢不同，IR 組USAG-1 蛋白的表達水平均隨著再灌注時間的延長而上調(diào)。相反的是，與IR 組各對應(yīng)時間點相比，IPostC 組USAG-1 蛋白的表達水平明顯降低。由此判斷，腎IPostC 除了上調(diào)BMP-7 表達外，還可通過下調(diào)腎組織BMP-7 內(nèi)源性拮抗劑USAG-1 的表達，進而增強BMP-7 的生物學(xué)活性。

Smads 蛋白家族是BMP-7 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要胞漿遞質(zhì)，其中Smad1、Smad5 和Smad8 是胞內(nèi)介導(dǎo)BMP 信號通路中重要的下游信號分子，在靶基因的轉(zhuǎn)錄中起著非常重要的作用。本實驗結(jié)果表明，腎再灌注24 h 后，p-Smad1/5/8 表達水平明顯低于sham 組，而IPostC 組p-Smad1/5/8 蛋白的表達量高于IR 組，這與BMP-7 變化趨勢基本相一致。因此可以推測腎IPostC 的保護作用很可能與激活BMP-7/Smads 信號通路有關(guān)。

細胞凋亡是機體在受到生理和病理性刺激后，由基因控制的細胞自主有序的死亡。研究表明，腎小管上皮細胞的凋亡貫穿于急性腎IRI 修復(fù)整個過程，是腎小管上皮細胞死亡的最主要形式[9]。本實驗采用TUNEL 染色檢測細胞凋亡水平，結(jié)果顯示，IR 組12h、24 h 時間點腎小管上皮細胞凋亡較多，AI 明顯高于sham 組；與IR 組對應(yīng)時間點相比，IPostC 組腎小管上皮細胞的凋亡明顯減少，AI 較低。諸此表明，腎IPostC 可通過抑制腎小管上皮細胞凋亡來減輕腎IRI。此外，還對凋亡指數(shù)AI 和p-Smad1/5/8 蛋白表達水平作了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，兩者間存在顯著的負相關(guān)性，提示Smad 蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可引起腎小管上皮細胞凋亡的變化。至于p-Smad1/5/8 蛋白是如何抑制腎小管上皮細胞的凋亡，尚需深入研究。

綜上所述，本研究證實了腎IPostC 能夠上調(diào)腎組織BMP-7 的表達，下調(diào)BMP-7 內(nèi)源性拮抗劑USAG-1 的表達，進而通過激活BMP-7/Smad1/5/8信號通路來抑制腎小管上皮細胞凋亡，從而產(chǎn)生機體的內(nèi)源性保護作用。