余姣姣, 劉家斌, 徐永濤, 吳永勝, 楊雪, 齊桂蘭*

1. 成都市農(nóng)林科學(xué)院 畜牧研究所，四川 成都 611130；

2. 成都大熊貓繁育研究基地，四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 610081

成都麻羊，又名四川銅羊，原產(chǎn)于成都平原及附近丘陵地區(qū)，是我國(guó)優(yōu)良肉用地方山羊品種[1,2]。成都麻羊具有生長(zhǎng)發(fā)育快、體格較大、性早熟、繁殖能力強(qiáng)、屠宰率高、膻味輕、肉質(zhì)嫩、板皮優(yōu)良、肉皮兼用等顯著特點(diǎn)，現(xiàn)有丘陵型和山地型兩個(gè)生態(tài)類型[1-3]。在我國(guó)，早有引進(jìn)成都麻羊改良當(dāng)?shù)厣窖蚺嘤缕贩N的案例，如四川省有名的南江黃羊、金堂黑山羊品種[1-3]。但是，圈養(yǎng)規(guī)模較小、缺乏科學(xué)的管理、近親繁殖現(xiàn)象等問題會(huì)導(dǎo)致成都麻羊的遺傳變異丟失[4]，引起圈養(yǎng)種群退化，長(zhǎng)期會(huì)導(dǎo)致遺傳多樣性逐漸喪失，一些特有的重要基因資源會(huì)在培育中消失殆盡，同時(shí)會(huì)造成個(gè)體適應(yīng)能力變?nèi)?，抗病力差，死亡率增加等[5]，長(zhǎng)期下來(lái)會(huì)影響圈養(yǎng)成都麻羊種群的健康發(fā)展。畜禽遺傳資源本質(zhì)上是基因資源，保護(hù)畜禽遺傳資源就是保護(hù)基因的多樣性[6]。因此，成都麻羊作為我國(guó)山羊品種的一個(gè)寶貴基因庫(kù)，維持其種群遺傳多樣性，最大限度地降低遺傳損失，保證其種群遺傳健康，對(duì)其種群種質(zhì)資源的良性發(fā)展和種群的遺傳管理都具有重要意義。

微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA），是以少數(shù)幾個(gè)核苷酸為基本單位進(jìn)行多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，因而也被稱為簡(jiǎn)單序列重復(fù)（simple sequence repeat，SSR）或短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）[6-9]。相比其他的分子標(biāo)記技術(shù)，微衛(wèi)星DNA標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)突出，如呈現(xiàn)共顯性遺傳、高度多態(tài)性等，是目前最為準(zhǔn)確、先進(jìn)的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)之一，是種群遺傳結(jié)構(gòu)研究和多樣性評(píng)估最常用的工具[5,7,10-14]。在山羊、綿羊中，利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記測(cè)定遺傳多樣性已有較多相關(guān)研究[9,11,15-21]。

鑒于此，為了加強(qiáng)成都麻羊資源的保護(hù)和利用，實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)地方山羊品種種質(zhì)資源的良性開發(fā)，滿足市場(chǎng)對(duì)成都麻羊的發(fā)展需求，借助微衛(wèi)星DNA作為遺傳標(biāo)記，對(duì)成都麻羊圈養(yǎng)種群進(jìn)行遺傳多樣性現(xiàn)狀調(diào)查，以期為該資源群體的遺傳背景研究提供分子理論依據(jù)，同時(shí)對(duì)合理利用成都麻羊資源和可持續(xù)發(fā)展也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本研究以成都西嶺雪農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司（四川省成都市大邑縣）飼養(yǎng)的成都麻羊?yàn)檠芯繉?duì)象，共隨機(jī)挑選268只個(gè)體采集血液樣品，其中雄性個(gè)體18只，雌性個(gè)體250只。對(duì)每只成都麻羊個(gè)體進(jìn)行頸靜脈采血5 mL，隨后用EDTA抗凝混勻，置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，?20 ℃保存。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取與檢測(cè)

本研究采用Tianamp基因組DNA提取試劑盒提取DNA，提取步驟參照使用說明書執(zhí)行。將提取得到的DNA用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，并將其保存于?20 ℃冰箱。

參考已發(fā)表文獻(xiàn)[7,9,10,16,17,20,21]，共選46對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選，有9對(duì)引物（見表1）能較穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增得到多態(tài)性較高的微衛(wèi)星位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增體系（20 uL）：DNA模板（濃度25 ng/uL）2 uL，正向引物（濃度10 umol/ul）0.5 uL，反向引物（濃度10 umol/ul）0.5 uL，Mix溶液10 uL，滅菌雙蒸水7 uL。PCR擴(kuò)增條件：首先95 ℃預(yù)變性持續(xù)15 min；之后94 ℃變性持續(xù)30 s，相應(yīng)退火溫度退火持續(xù)30 s，72 ℃延伸持續(xù)30 s，并設(shè)置30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃終止延伸持續(xù)10 min。每次擴(kuò)增過程中均設(shè)定陰性對(duì)照，每個(gè)樣品擴(kuò)增3次。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后拍照。

表 1 本研究所用微衛(wèi)星 DNA 標(biāo)記Tab. 1 Microsatellite DNA markers were used in this study

1.2.2 基因分型

使用GeneMarker V2.2.0（Demo）軟件，根據(jù)DNA片段大小范圍和峰形質(zhì)量確認(rèn)等位基因。3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)分型一致的結(jié)果直接錄入數(shù)據(jù)庫(kù)，若結(jié)果有差異，則需要重新跑PCR甚至重新提取DNA。利用 Excel 2007軟件整理所有樣品對(duì)應(yīng)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因型數(shù)據(jù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

利用Micro-Checker[22]檢驗(yàn)每個(gè)位點(diǎn)是否存在無(wú)效等位基因或等位基因缺失等情況。利用Genepop on the Web[23]和GenAlEx[24]軟件，對(duì)每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)是否偏離哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）和是否存在連鎖不平衡（Linkage disequilibrium，LD）進(jìn)行分析。哈迪-溫伯格平衡檢測(cè)中，若P>0.05，則符合哈代-溫伯格平衡，說明這個(gè)群體是隨機(jī)交配群體；若P<0.05，則呈顯著偏離哈代-溫伯格平衡狀態(tài)；若P<0.01，則呈極顯著偏離哈代-溫伯格平衡狀態(tài)。利用Cervus、GenAlEx、Excel Microsatellite Toolkit統(tǒng)計(jì)各個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的等位基因數(shù)（k）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測(cè)雜合度（Observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（Expected heterozygosity，He）和多態(tài)信息含量（Polymorphism information content，PIC）[24,25]。當(dāng)PIC<0.25、0.250.5時(shí)，分別表示該座位為低度、中度和高度多態(tài)位點(diǎn)，其中高度多態(tài)位點(diǎn)能夠提供大量的遺傳信息，中度多態(tài)位點(diǎn)可以提供較為合理的信息[10,11,13,20,21,26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)

本研究篩選得到的9對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)中，高度多態(tài)標(biāo)記位點(diǎn)有5對(duì)（PIC>0.5），可提供大量的遺傳信息，中度多態(tài)標(biāo)記位點(diǎn)有3對(duì)（0.25

依據(jù)哈代-溫伯格平衡檢測(cè)中的P值，9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中有7個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)符合哈代-溫伯格平衡，占77.8%；另外2個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)（INRA063和SRCRSP-5）顯著偏離哈代-溫伯格平衡，占22.2%。

依據(jù)連鎖不平衡檢測(cè)結(jié)果，9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)之間均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象（P>0.001），表明所選用的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)是相互獨(dú)立的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)。

2.2 種群遺傳多樣性分析

排除SR-CRSP-1外之后，使用剩余的8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)對(duì)圈養(yǎng)成都麻羊種群進(jìn)行遺傳多樣性分析，共有60個(gè)等位基因被成功檢測(cè)，各標(biāo)記位點(diǎn)的等位基因數(shù)介于5～11之間，平均值為7.5；各標(biāo)記位點(diǎn)的平均有效等位基因數(shù)為2.36個(gè)；各個(gè)位點(diǎn)私有等位基因檢測(cè)并未發(fā)現(xiàn)其存在；觀察雜合度的變異范圍是0.413～0.770，平均值是0.577；期望雜合度的變異范圍是0.493～0.777，平均值是0.634；多態(tài)信息含量的變異范圍是0.432～0.743，平均值是0.580（見表3）。

表 2 9 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果Tab. 2 Polymorphism detection results of 9 microsatellite markers

表 3 圈養(yǎng)成都麻羊種群遺傳多樣性情況Tab. 3 Genetic diversity of captive Chengdu gray goat population

2.3 微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)等位基因分布

在8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中，等位基因較多的前4個(gè)是：ILSTS004，共檢測(cè)到11個(gè)等位基因，大小分 布 在 111～131 bp， 頻 率 范 圍 為 0.0038～0.6000；OarFCB48，共檢測(cè)到9個(gè)等位基因，大小分布在148～168 bp，頻率范圍為 0.0039～0.3262；SR-CRSP-5，共檢測(cè)到8個(gè)等位基因，大小分布在168～186 bp，頻率范圍為0.0077～0.5613；OarFCB011，共檢測(cè)到8個(gè)等位基因，大小分布在133～157 bp，頻率范圍為0.0019～0.4615（見圖 1）。

圖 1 微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的等位基因分布Fig. 1 Allele frequency of microsatellite markers

在8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)中，等位基因較少的4個(gè)位點(diǎn)是：ILSTS033，共檢測(cè)到7個(gè)等位基因，大小分布在 148～166 bp，頻率范圍為 0.0057～0.6985；ILSTS030，共檢測(cè)到7個(gè)等位基因，大小分布在161～175 bp，頻率范圍為 0.0019～0.4775；McM038，共檢測(cè)到5個(gè)等位基因，大小分布在123～139 bp，頻率范圍為 0.0038～0.6629；INRA063，共檢測(cè)到5個(gè)等位基因，大小分布在160～168 bp，頻率范圍為 0.0138～0.4685（見圖 1）。

3 討論與結(jié)論

遺傳多樣性是一個(gè)物種適應(yīng)環(huán)境變化所必需的條件[7]。種群內(nèi)的遺傳多樣性反映了一個(gè)物種的進(jìn)化潛力，是其遺傳特征進(jìn)化的基礎(chǔ)[26]。一個(gè)物種的遺傳變異越豐富，其對(duì)自然選擇和環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)[6,9,12,27]。遺傳多樣性通常用等位基因多樣性、多態(tài)性、平均雜合度等指標(biāo)來(lái)描述[6,12,16,19]。

在同一微衛(wèi)星位點(diǎn)中，隨著核心重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)的變化，該位點(diǎn)的片段長(zhǎng)度也會(huì)發(fā)生變化，繼而形成等位基因[11,17]；等位基因是形成群體遺傳多態(tài)性的基礎(chǔ)，等位基因數(shù)越多，遺傳多態(tài)性越豐富[17]。評(píng)價(jià)位點(diǎn)多態(tài)性高低的指標(biāo)是多態(tài)信息含量[17]。本研究從9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中篩選到5個(gè)高度多態(tài)的位點(diǎn)、3個(gè)中度多態(tài)性的位點(diǎn)、1個(gè)低度多態(tài)性的位點(diǎn)，因此僅有前8個(gè)可作為有效的分子標(biāo)記進(jìn)行群體遺傳多樣性分析。在后續(xù)的分析中我們使用了這8個(gè)中高度多態(tài)的微衛(wèi)星位點(diǎn)分析了268份成都麻羊樣品，最終在這8個(gè)位點(diǎn)中一共檢測(cè)到的等位基因數(shù)為60個(gè)，平均等位基因數(shù)為7.5，與其他綿羊種群相比，要高于甘肅高山細(xì)尾羊、灘羊、藏羊等[7]，低于山東省的小尾寒羊、大尾寒羊、山地綿羊、洼地綿羊等[28]，與四川省布拖黑綿羊種群基本持平[10]，但與其他山羊種群相比，要高于山西黎城大青羊、山西呂梁黑山羊、寧夏中衛(wèi)山羊、貴州白山羊、云南威信白山羊等[11,16,19]，低于湖南湘東黑山羊、重慶川東白山羊、云南云嶺山羊、河南黃淮山羊等[11]。不過，這并不能排除種群大小和所用微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)不同而造成的差異。有研究表明，如果樣本量太少，會(huì)導(dǎo)致一些頻率較低的等位基因無(wú)法被檢測(cè)到，進(jìn)而對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響[9]。本研究使用了8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析了268份成都麻羊樣品，微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)量屬于平均水平，種群樣本量較大，而個(gè)別其他研究的樣本量最少僅有20余份[11,17]，微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)量最少僅有5個(gè)[7,17]。以同一微衛(wèi)星位點(diǎn)而言，種群樣本量越大，其觀察到的等位基因數(shù)往往越多，以微衛(wèi)星位點(diǎn)ILSTS004、OarFCB011和ILSTS030為例，本研究中觀察到的等位基因數(shù)目分別為11、8和7，而在劉成建的研究中（涉及20個(gè)樣本量）僅為5和4[17]。此外，在本項(xiàng)研究中，成都麻羊群體中8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息含量的變異范圍是0.432～0.743，平均多態(tài)信息含量0.580，與劉成建的研究結(jié)果（0.604）基本一致[17]，表明了成都麻羊群體具有較豐富的遺傳多樣性。

基因雜合度，它反映了群體在幾個(gè)位點(diǎn)的遺傳變異情況，是被檢測(cè)的遺傳標(biāo)記的多態(tài)性的度量參數(shù)[10,17]。若某個(gè)群體的基因雜合度大于0.5，則意味著該群體還未受到高強(qiáng)度的選擇壓力，其遺傳多樣性比較豐富[10,17]。在本項(xiàng)研究中，成都麻羊群體的平均觀察雜合度和平均期望雜合度分別為0.577和0.634，表明該群體有較豐富的遺傳多樣性，該結(jié)果與前述多態(tài)性的分析結(jié)果相一致。另外，劉若余等人基于線粒體D-loop序列調(diào)查了中國(guó)9個(gè)山羊品種的遺傳多樣性，其中成都麻羊的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為 1.0000±0.0243和 0.017956±0.004410，同樣表明其有著豐富的遺傳多樣性[29]。

有效等位基因數(shù)也可以反應(yīng)群體的遺傳變異大小，在數(shù)值上等于基因純合度的倒數(shù)[9,16,17]。若有效等位基因數(shù)越接近所檢測(cè)到的等位基因的絕對(duì)數(shù)，則說明等位基因在群體中分布越均勻[9,16,17,21]。本研究中，成都麻羊群體平均有效等位基因數(shù)（2.36）低于實(shí)際觀測(cè)到的等位基因數(shù)（7.5），說明有些等位基因頻率相對(duì)較高，而另一些相對(duì)較低，等位基因在群體中分布得并不均勻，圖1也具體地展示了這一現(xiàn)象，究其原因應(yīng)該是圈養(yǎng)種群頻繁人工選擇和一定的近親繁殖造成的。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，成都麻羊群體的觀察雜合度和期望雜合度之間差異很小，僅為0.057，這說明就目前而言，成都麻羊群體受外來(lái)選擇壓力和近交繁殖等因素的影響還比較小，群體依舊處于遺傳平衡的狀態(tài)

種群遺傳學(xué)管理的目的是保持種群的遺傳多樣性，避免近親繁殖[30]。如果對(duì)一個(gè)封閉的小種群不采取任何人工干預(yù)措施，最終必將造成近親交配，進(jìn)而引發(fā)近交衰退。鑒于成都麻羊種群的遺傳多樣性還比較高，受近親繁殖等因素影響還較小，具有較高的保種潛力，建議開展全面采樣，借助微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)，完善個(gè)體信息檔案，構(gòu)建起具有完整代表性的成都麻羊種群遺傳譜系關(guān)系。