李文俊, 姜麗瓊, 劉瓊, 肖前剛, 浣杰, 徐志萍, 楊洪燕

成都市農(nóng)林科學(xué)院，四川 成都 611130

白及[Bletilla striata(Thunb.) H.G.Reichenbach]是蘭科白及屬的多年生草本植物[1]，主要分布在云南、四川和貴州等地[2]，白及具有廣泛的藥用價值及園林價值，白及以根莖入藥，具有收斂止血、消腫生肌等功效，是我國重要的中藥材[3]，亦可作為盆栽室內(nèi)觀賞，點綴于較為蔭蔽的花臺、花境或庭院一角[4]。此外，白及亦是裝裱書畫的高品質(zhì)粘合劑，并廣泛應(yīng)用于高檔美容化妝品及保健等行業(yè)[5]。

白及屬植物種間和種內(nèi)遺傳分化強烈[6]，本研究在白及資源調(diào)查和收集過程中，發(fā)現(xiàn)白及表型變異程度較大，主要表現(xiàn)在株型、花型、花色、花期、花量、花莖、葉片形態(tài)、托葉宿存情況及托葉大小及抗逆性等方面，花色有白色、淡粉色、粉紫色、紫色、深紫色等，開花時間主要在3—5月之間變化，葉片形態(tài)存在寬窄差異，從表型看，白及種內(nèi)差異較大。

nrDNA ITS序列是位于真核生物nrDNA18S和26S之間的內(nèi)含子[7]，由于進(jìn)化中的選擇壓力小，nrDNA ITS片段在物種水平的變異較快，有更多的突變位點以區(qū)分不同的物種，常用于物種鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究[8]。而在蘭科植物中，Kurt[9]等指出蘭科植物的ycf1（Hypothetical chloroplast openreading frame 1）基因具有高度變異性，并比matK基因更具有可靠的變異信息位點。本研究收集來源于四川和云南的30個白及單株，克隆并分析其nrDNA ITS序列和葉綠體ycf1序列的差異基因，以期為白及遺傳分化研究鑒定提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在四川和云南采集白及野生種和栽培種共30個樣本，樣本植株移栽在成都市農(nóng)林科學(xué)院科研基地，試驗時選擇成熟個體，取無病蟲害的葉片立即放在液氮中，-80 ℃保存待用（見表1）。

1.2 總 DNA 提取、目的序列的 PCR 擴增與測序

采用植物DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）提取DNA，并參考吳勁松[10]文獻(xiàn)中ITS、ycf1基因引物及相關(guān)體系進(jìn)行 PCR 擴增、電泳檢測、切膠回收、測序（見表2）。

表 1 供試材料表Tab. 1 Basic information of the tested materials

表 2 引物序列Tab. 2 Primer sequences

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用DNAstar軟件分析ITS和ycf1序列的長度和G+C含量；運用DNAMAN 工具對ITS和ycf1序列進(jìn)行多序列比對，分析序列的同源性，采用鄰位連接法（Neighbor-Joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，選擇檢驗方法為“Bootstrap method”，重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000，應(yīng)用軟件MEGA7.0[11]（Molecular evolution genetics analysis）分子進(jìn)化遺傳分析軟件分析系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征

對30個白及樣本的nrDNA ITS和葉綠體ycf1序列進(jìn)行擴增，如表3所示，獲得ITS序列長度為633?742 bp，GC含量為 59.97%～61.64%，ycf1序列長度為864～969 bp，GC含量為27.76%～28.47%。

表 3 序列長度及 GC 含量Tab. 3 Sequence length and GC content

2.2 遺傳多樣性

通過比對，確定本研究涉及材料nrDNA ITS序列和葉綠體ycf1序列存在不同程度的變異，根據(jù)ycf1基因共鑒定出5個單倍型，存在4個變異位點，B_4和B_5屬于B型，B_11屬于C型，B_12屬于D型，B_16屬于E型，其余25個樣本屬于A型，具體變異情況見表4。

相比較葉綠體ycf1基因，nrDNA ITS基因變異程度較大，共鑒定出11個單倍型，存在32個變異位點，其中 B_1、B_2、B_3、B_6、B_15、B_23屬于 A型 ， B_4、 B_5、 B_14屬 于 B型 ， B_7、B_16、B_17、B_18、B_25、B_26、B_27、B_28 屬于 C型，B_8、B_9、B_10屬于 D型，B_19、B_20、 B_21、 B_29屬 于 E 型 ， B_11、 B_12、B_13、B_22、B_24、B_30分別屬于 F、G、H、I、J、K型，具體變異情況見表5。

表 4 葉綠體 ycf1基因變異情況Tab. 4 Variation of ycf1 genes in chloroplasts

表 5 nrDNA ITS 基因變異情況Tab. 5 Variation of nrDNA ITS genes

本研究中，共得到白及30條ITS序列，共鑒定出11個單倍型，表現(xiàn)出很高的雜合性，構(gòu)建NJ樹，發(fā)現(xiàn)30份白及材料分為3個支系，A型、B型、E型聚為一支，B_8和F、G、H、I、J、K型聚為一支，C型和D型聚為一支（見圖1）。

圖 1 基于 ITS 序列的白及系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Bletilla striata based on ITS sequence

3 結(jié)論與討論

白及屬植物具有較高的遺傳多樣性。孫宇龍[12]等通過SRAP分子標(biāo)記探討了12個白及野生居群的遺傳多樣性和居群遺傳結(jié)構(gòu)，表明白及物種有著豐富的遺傳多樣性，認(rèn)為白及居群間存在中等水平的遺傳分化。周天華[13]等構(gòu)建白及SSR指紋圖譜，認(rèn)為白及屬在種間水平均有較高的遺傳多樣性，物種間遺傳分化強烈，物種間的基因流較弱。

本研究比較30個白及樣本的ITS序列和ycf1序列，發(fā)現(xiàn)ycf1序列變異較小，ITS序列變異較大，種內(nèi)遺傳多樣性豐富。相比較A型，B_12、B_13、B_13和B_22的ITS序列變異較大，分別發(fā)生了20、22、24和21個基因位點變異，此四個樣本變異情況相似，且在表觀上均表現(xiàn)出葉型狹長、花期晚的性狀，根據(jù)ITS序列差異，將30份白及材料聚類為3個支系，結(jié)合白及的表觀性狀，發(fā)現(xiàn)白及ITS序列與其花期和葉型有相關(guān)性，與花型、花色等其他性狀無明顯相關(guān)。

種質(zhì)資源是中藥材遺傳育種和品種選育的基礎(chǔ)，目前，市場上流通的白及藥材種質(zhì)來源廣泛，質(zhì)量參差不齊。種源不清、種子種苗質(zhì)量參差不齊，是影響白及規(guī)范化種植和白及藥材質(zhì)量的重要因素[14]。本研究收集白及種質(zhì)資源，克隆并分析白及nrDNA ITS和葉綠體ycf1序列，為白及種質(zhì)資源開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)將對這批白及種質(zhì)資源的化學(xué)成分、抗逆性和其他品質(zhì)性狀進(jìn)行深入研究，以期為選育產(chǎn)量高、抗逆性強、品質(zhì)優(yōu)的新品種提供材料基礎(chǔ)。