鐘楠蝶, 李登飛, 楊有芹, 魏麗君, 王瓊*

1. 西華師范大學(xué)西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637000；

2. 西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637000；

3. 華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430079

傳粉過程是研究花部特征和傳粉者關(guān)系的紐帶，進(jìn)而也為研究花部特征進(jìn)化提供了契機(jī)[1]。傳粉昆蟲往往會(huì)對(duì)某一色系的花產(chǎn)生偏愛[2,3]，花色也成為植物吸引傳粉者重要“廣告特征”之一[4,5]。由于傳粉者不能在距離花朵0.4 m以外分辨出是否有報(bào)酬，因此開花植物往往通過花色近距離吸引傳粉者，即傳粉者對(duì)顏色的偏好則在近距離內(nèi)發(fā)生選擇性作用[5]。盜蜜是指訪花者直接在蜜距或是花冠上打洞，不進(jìn)行授粉僅取食花蜜的行為，是影響植物與傳粉者互利共生關(guān)系關(guān)鍵的生物因素之一[6,7]。在動(dòng)植物的相互關(guān)系中，盜蜜被認(rèn)為是一種不同于普通傳粉者的不正常的訪花行為，盜蜜者除了作為似盜蜜傳粉的正效應(yīng)之外，還可能改變對(duì)正常傳粉者的訪花行為[8]。一些研究結(jié)果顯示，盜蜜對(duì)植物的結(jié)實(shí)可能不會(huì)產(chǎn)生影響，但也有可能會(huì)通過影響傳粉者行為而影響傳粉者介導(dǎo)的結(jié)實(shí)[9]。總之，盜蜜如何通過影響植物與傳粉者的互利共生關(guān)系，最終影響植物的適合度與進(jìn)化仍不明了。通過人工操縱法隔離盜蜜者作為對(duì)照，可針對(duì)性評(píng)價(jià)盜蜜的生態(tài)學(xué)后果，有利于更深入地研究多物種間的相互作用和協(xié)同進(jìn)化。用紗網(wǎng)袋套住植物的花冠或蜜距隔離盜蜜者時(shí)，紗網(wǎng)袋顏色可能會(huì)干擾傳粉者正常訪問，因?yàn)閭鞣壅咄珢勰撤N顏色的花[2,3]。因而，篩選出一種對(duì)傳粉者干擾最小的紗網(wǎng)袋顏色成為最急需解決的問題。研究盜蜜對(duì)傳粉者訪花行為的影響，若在傳粉者訪問的高峰時(shí)間段進(jìn)行觀測(cè)，效果更明顯，因而傳粉者一天中的訪花節(jié)律也值得進(jìn)一步探討。研究發(fā)現(xiàn)，傳粉者一天中的訪問節(jié)律與環(huán)境因子以及植物的花部特征、花蜜產(chǎn)量等密切相關(guān)[10-12]，每個(gè)時(shí)間段的花蜜體積、糖濃度變化尤為明顯[13]，這意味著傳粉者在不同時(shí)間的訪花頻率存在一定差異。那么，找到一天之中傳粉者訪花頻率最高的時(shí)段，也可為有效的人工授粉時(shí)間提供依據(jù)。若能有效地提高植物的授粉概率，可為促進(jìn)植物的生殖成功提供參考。

鳳仙花屬（ImpatiensL.）是被子植物中的一個(gè)大屬，隸屬于鳳仙花科（Balsaminaceae），全世界共有900多種，中國作為世界鳳仙花屬的分布中心之一，擁有該屬240多個(gè)物種[14]。鳳仙花屬家族龐大，花朵嬌嫩多汁，花部結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且具有非常廣泛的多樣性和各個(gè)類型的傳粉者，是比較理想的研究植物分類學(xué)的材料，也是眾多傳粉生物學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)類群[15-17]。擁有長(zhǎng)花冠筒或是蜜距的植物容易被盜蜜，在該屬植物中，長(zhǎng)蜜距花被盜蜜的現(xiàn)象十分普遍[15,18,19]。研究盜蜜通過影響傳粉者行為而介導(dǎo)該屬植物的生殖成功對(duì)于理解多物種的相互作用機(jī)制及其后果具有重要的意義。

因此，選擇了4種顏色（黑、白、紅、綠）紗網(wǎng)袋套蜜距，以不套蜜距作為對(duì)照，在一天中6個(gè)時(shí)間段，分別觀測(cè)紅雉鳳仙花傳粉者的訪花頻率和單花停留時(shí)間，以篩選出對(duì)傳粉者訪花行為影響最小的紗網(wǎng)袋顏色和最佳的訪問時(shí)間段，便于后續(xù)開展盜蜜的生態(tài)學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 研究地自然概況

實(shí)驗(yàn)地位于四川省峨眉山萬年寺附近，該區(qū)屬于亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，主要植被類型是以常綠闊葉為主的亞熱帶植被，平均氣溫17.2 ℃，雨量充沛，年均降雨量約1 764 mm[20]。峨眉山因資源植物種類豐富而位居于我國三大資源植物區(qū)域之首，尤其是在藥用、觀賞和食用等方面的資源植物最為豐富多樣[21]。峨眉山擁有的植物約占中國植物物種總數(shù)的1/10，其中特有鳳仙花有12種[22]，是我國鳳仙花屬植物的集中分布區(qū)之一。

1.2 研究材料

研究材料是我國特有植物紅雉鳳仙花（Impatiens oxyantheraHook.f），隸屬于鳳仙花科（Balsaminaceae）鳳仙花屬（ImpatiensL.）。紅雉鳳仙花高20～40 cm，全株無毛?？偦üＩ谏喜咳~腋，長(zhǎng)于葉柄短于葉；苞片卵形，頂端突尖；花大，紅色或淡紫紅色[14]。花冠筒長(zhǎng)約為20.4 mm，蜜距長(zhǎng)約29.5 mm[10]。其主要的傳粉者為三條熊蜂（Bombus trifasciatusSmith），主要的盜蜜者為短頭熊蜂（Bombus brevicepsSmith），前期觀察該植物發(fā)現(xiàn)盜蜜程度可達(dá)90.58%[15]。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)在峨眉山市黃灣鄉(xiāng)黑水村租用的農(nóng)用地（29°36′N，103°21′E，海拔 908 m）中進(jìn)行。2017年3月底，將野生紅雉鳳仙花幼苗移栽至花盆。花盆底部先鋪放一層瓦片以便排水透氣，再裝入農(nóng)用地土壤，每個(gè)花盆中施有機(jī)肥100 g。每個(gè)花盆栽種1株幼苗，共216株，將所有花盆放置在6個(gè)2 m ×2 m小區(qū)中，每個(gè)小區(qū)內(nèi)按6行6列放置。紅雉鳳仙花喜陰濕環(huán)境，在試驗(yàn)地上方覆蓋一層黑色塑料遮陽網(wǎng)（型號(hào)XN-95，遮陽網(wǎng)下相對(duì)光強(qiáng) 24 %，都江堰市新農(nóng)遮陽網(wǎng)廠）。實(shí)驗(yàn)期間常澆水除草，夏季炎熱時(shí)，早晚澆水1次，以保證植株正常生長(zhǎng)。

紅雉鳳仙花的花期在8—9月，雌雄異熟。于2017年8月下旬開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)采用單因素變量法。實(shí)驗(yàn)處理前一天使用白色尼龍網(wǎng)袋（40目，15 cm × 10 cm）對(duì)未開放的花蕾進(jìn)行套袋，以防止盜蜜，減少實(shí)驗(yàn)干擾。第二天，選取已開放的花分組，每組5朵，每組用4種不同顏色（黑色、白色、紅色、綠色）的紗網(wǎng)袋（9 cm × 7 cm）套蜜距，余下1朵自然狀態(tài)不做處理作為對(duì)照（見圖1）。紅色紗網(wǎng)袋與紅雉鳳仙花的花冠顏色相近，綠色紗網(wǎng)袋則與植物葉片顏色相似，另外選擇對(duì)比強(qiáng)烈的黑色和白色紗網(wǎng)袋進(jìn)行對(duì)比。每天4人共觀察8組（每人2組），重復(fù)觀察3 d，共24個(gè)重復(fù)組。

1.4 指標(biāo)觀測(cè)

傳粉者的訪問頻率的觀測(cè)。于2017年8月21日—8月23日每天上午9:00—9:30、10:00—10:30、11:00—11:30和下午 14:30—15:00、15:30—16:00、16:30—17:00共6個(gè)時(shí)間段，4人分別記錄5種實(shí)驗(yàn)處理的目標(biāo)花朵被傳粉者訪問的次數(shù)。每種處理的8朵花共觀察72 h。

圖 1 用不同顏色紗網(wǎng)袋對(duì)紅雉鳳仙花蜜距進(jìn)行套袋Fig. 1 Bagging the nectar spur of Impatiens oxyanthera with different colored gauze bags

傳粉者訪花單花停留時(shí)間的觀測(cè)。于2017年8月21日—8月23日每天9:30—9:50、10:30—10:50、11:30—11:50、15:00—15:20、16:00—16:20、17:00—17:20共6個(gè)時(shí)間段，4人分別用秒表記錄實(shí)驗(yàn)處理的5朵花在上述6個(gè)時(shí)間段，不同套袋處理花朵被傳粉者訪問時(shí)的單花停留時(shí)間。每種處理的8朵花共觀察48 h。

1.5 數(shù)據(jù)計(jì)算與分析

用Excel、SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制。數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性分別用非參數(shù)檢驗(yàn)中的單樣Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)和Levene法檢驗(yàn)。因數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，故采用非參數(shù)檢驗(yàn)的多個(gè)獨(dú)立樣本的Kruskal-Wallis H(K)檢驗(yàn)分析5種處理之間平均值差異的顯著性，檢驗(yàn)蜜距所套不同紗網(wǎng)袋的顏色以及時(shí)間段兩個(gè)因素對(duì)傳粉者訪問頻率和單花停留時(shí)間的影響。在R語言（版本3.6.3）中，用rcompanion包scheirerRayHare()函數(shù)分析紗網(wǎng)袋顏色、觀測(cè)時(shí)間段以及兩者的交互作用對(duì)傳粉者訪問頻率和單花停留時(shí)間影響的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳粉者的訪問頻率

研究發(fā)現(xiàn)，紗網(wǎng)袋顏色和觀測(cè)時(shí)間段兩者的交互作用對(duì)傳粉者訪花頻率影響不顯著（H= 20.395，P> 0.05）（見圖2）。不同顏色紗網(wǎng)袋對(duì)傳粉者訪花頻率差異顯著（χ2= 15.977，P< 0.05）（見圖3），尤其在上午9:00—9:30時(shí)間段內(nèi)，黑色紗網(wǎng)袋標(biāo)記的花朵被訪問頻率顯著低于其他處理（χ2= 10.765，P< 0.05）。對(duì)照花朵單花被訪問頻率最高（0.611 ±0.027次·30 min?1），白色紗網(wǎng)袋標(biāo)記的花朵被訪問次數(shù)次之（0.576 ± 0.036 次·30 min?1），黑色紗網(wǎng)袋標(biāo)記的花朵被訪問的頻率最少（0.285 ± 0.021次·30 min?1），對(duì)照花朵比黑色紗網(wǎng)袋標(biāo)記的花朵平均訪問頻率高 0.326 ± 0.006 次·30 min?1（見圖 3），白色紗網(wǎng)袋標(biāo)記花朵的訪問頻率與對(duì)照組花朵最接近。

其中，觀測(cè)時(shí)間段對(duì)目標(biāo)花朵被傳粉者訪問的頻率影響顯著（χ2= 30.814，P< 0.001）（見圖 4），在觀測(cè)的6個(gè)時(shí)間段中，下午14:30—15:00單花訪問頻率最高（0.725 ± 0.028 次·30 min?1），分別顯著高于上午11:00—11:30、下午15:30—16:00以及16:30—17:00的相應(yīng)值。在上午和下午前半段的訪花頻率均高于后半段，特別是下午，即上下午均出現(xiàn)了一個(gè)訪花的高峰期。9:00—9:30、10:00—10:00、14:30—15:00這3個(gè)訪花頻率較高時(shí)間段的訪花頻率約為其他3個(gè)時(shí)間段的1.75倍。

2.2 傳粉者的單花停留時(shí)間

圖 2 不同顏色和時(shí)間段的紗網(wǎng)袋對(duì)傳粉者訪問頻率的影響Fig. 2 Effects of different gauze bag colors and observation time periods on the visiting frequency of pollinators

圖 3 不同顏色的紗網(wǎng)袋對(duì)傳粉者訪問頻率的影響Fig. 3 Effects of different gauze bag colors on the visiting frequency of pollinators

紗網(wǎng)袋顏色和觀測(cè)時(shí)間段兩者的交互作用對(duì)傳粉者單花停留時(shí)間影響不顯著（H= 22.307，P> 0.05）（見圖5）。非參數(shù)檢驗(yàn)表明，不同顏色紗網(wǎng)袋標(biāo)記花朵被傳粉者訪問停留的平均時(shí)間差異不顯著（χ2=2.306，P> 0.05）（見圖6），特別是在上午10:30—10:50期間，不同顏色紗網(wǎng)袋處理與對(duì)照組之間的傳粉者單花停留時(shí)間沒有幾乎差異。白色紗網(wǎng)袋標(biāo)記花朵平均停留時(shí)間最長(zhǎng)5.764 ± 0.238 s，黑色紗網(wǎng)袋標(biāo)記花朵被傳粉者訪問平均停留時(shí)間最短5.023 ±0.251 s，對(duì)照花朵平均停留時(shí)間5.133 ± 0.130 s。

不同時(shí)間段之間，傳粉者訪問花朵停留時(shí)間差異不顯著（χ2= 4.408，P> 0.05）（見圖 7）。上午9:30—9:50，訪花單花停留時(shí)間最長(zhǎng)6.327 ± 0.118 s，其他5個(gè)時(shí)間段內(nèi)單花停留時(shí)間相差無幾，平均停留5.299 ± 0.028 s。同時(shí)，在訪問頻率較高的時(shí)間段，5種紗網(wǎng)袋之間單花停留時(shí)間差異越小，而在訪問頻率較低的時(shí)間段，5種紗網(wǎng)袋之間單花停留時(shí)間差異越大。

圖 4 時(shí)間段對(duì)傳粉者訪問頻率的影響Fig. 4 Effects of observation time periods on the visiting frequency of pollinators

3 討論

3.1 紗網(wǎng)袋顏色對(duì)傳粉者訪花行為的影響

圖 5 不同顏色紗網(wǎng)袋、時(shí)間段對(duì)傳粉者單花停留時(shí)間的影響Fig. 5 Effects of different gauze bag colors and observation time periods on the visiting duration time of pollinators

圖 6 不同顏色紗網(wǎng)袋對(duì)傳粉者單花停留時(shí)間的影響Fig. 6 Effects of different gauze bag colors on the visiting duration time of pollinators

圖 7 時(shí)間段對(duì)傳粉者單花停留時(shí)間的影響Fig. 7 Effects of observation time periods on the visiting duration time of pollinators

花部綜合特征包括花色、形態(tài)、大小和氣味等[23]，而昆蟲訪花偏好受花部綜合特征影響[24]，有研究表明傳粉昆蟲對(duì)花色具有識(shí)別能力[25,26]，花色是吸引傳粉者訪問的重要因素之一，某一花色對(duì)傳粉者具有吸引力[2,3]，例如：熊蜂往往更喜歡訪問顏色艷麗的花朵，如粉紅色、黃色和藍(lán)紫色[27,28]。本研究表明，紗網(wǎng)袋顏色對(duì)目標(biāo)花朵被傳粉者訪問的頻率影響顯著，對(duì)照花朵被訪問頻率最多，其次是白色，最少的是黑色紗網(wǎng)袋套蜜距的花朵。由此可見，不同顏色的紗網(wǎng)袋確實(shí)會(huì)干擾傳粉者訪花的行為，且白色相對(duì)影響最小，黑色影響最大。紅雉鳳仙花花色為淡紫紅色，熊蜂喜歡粉紅色花冠，有研究發(fā)現(xiàn)白色花冠反射光譜的波峰與粉色的花冠有重合[27]，不會(huì)對(duì)花色產(chǎn)生太大干擾，因此套白色紗網(wǎng)袋的花相比其他紗網(wǎng)袋顏色更容易被熊蜂識(shí)別，所以訪花頻率更接近對(duì)照。黑色花顏色不艷麗、不易吸引昆蟲，加上黑色吸收全部光波，陽光下升溫快致使花組織受到傷害[29]，因此自然界黑色花很少。先前也有研究發(fā)現(xiàn)黑色令蜂類產(chǎn)生明顯的趨避作用[30]，與本研究結(jié)果相似。另一研究結(jié)果為紗網(wǎng)袋顏色對(duì)傳粉者單花停留時(shí)間無顯著影響。說明一旦傳粉者訪問花朵后，在花上停留的時(shí)間可能不受紗網(wǎng)袋顏色的影響，而受花朵的花部特征如花冠大小、花蜜體積和含糖量等的影響[11-13]。本實(shí)驗(yàn)的花為隨機(jī)選擇，并進(jìn)行隨機(jī)處理，故受試花朵在花冠大小、花蜜特征無顯著差異，并且紗網(wǎng)袋套蜜距外，傳粉者訪花是在花冠內(nèi)活動(dòng)，故傳粉者單花停留時(shí)間受其直接影響小。最終導(dǎo)致紗網(wǎng)袋顏色對(duì)傳粉者單花停留時(shí)間無顯著影響。

3.2 觀測(cè)時(shí)間段對(duì)傳粉者訪花行為的影響

傳粉者的活動(dòng)會(huì)受到氣溫、光照和蜜源豐富度等的影響[13,31]。本研究表明，觀測(cè)時(shí)間段對(duì)目標(biāo)花朵被傳粉者訪問的頻率和單花停留時(shí)間影響均顯著。下午14:30—15:00訪問次數(shù)最多，其次是上午9:00—9:30和10:00—10:30，而上午9:30—9:50單花停留時(shí)間最長(zhǎng)。傳粉者一天中的訪問節(jié)律與光照強(qiáng)度、氣溫等環(huán)境因子以及植物的花部特征、花蜜產(chǎn)量等有關(guān)[10-12]，使得傳粉者在不同的時(shí)間段內(nèi)其訪問頻率和單花停留時(shí)間差異顯著。上午9:30—9:50，單花停留時(shí)間最長(zhǎng)，有研究發(fā)現(xiàn)該時(shí)間段花蜜體積較多和果糖含量較高[13]，吸引傳粉昆蟲覓食。下午14:30—15:00訪問次數(shù)較多，該時(shí)間段也存在花蜜糖濃度升高的現(xiàn)象[13]，這與訪問次數(shù)多相對(duì)應(yīng)。

綜上所述，用白色紗網(wǎng)袋套紅雉鳳仙花蜜距對(duì)傳粉者訪花行為干擾最小，觀測(cè)時(shí)間以上午9:30—9:50和下午14:30—15:00為宜。這為今后開展盜蜜對(duì)植物與傳粉互利共生關(guān)系影響以及對(duì)傳粉者干擾最小的隔離方法等研究提供了新的參考。