李婷婷* 何冠軍 劉亞西 趙蕾 康道林 涂發(fā)平△

(1. 川北醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科，四川 南充 637100；2. 川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 南充 637100；3.高坪區(qū)人民醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 南充 637100；4. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，四川 南充 637000）

腎缺血再灌注損傷（renal ischemiareperfusion injury，RIRI）是在腎移植、腎切除等復(fù)雜腎臟手中常見的病理生理過程，是引起急性腎損傷和腎功能衰竭的重要原因之一，此過程不僅導(dǎo)致腎臟本身缺血再灌注損傷，還會(huì)引起遠(yuǎn)隔器官如肝、肺、腦等器官損傷[1-3]，其機(jī)制主要與再灌注過程中中性粒細(xì)胞的遷移、細(xì)胞因子的表達(dá)、氧化應(yīng)激的增強(qiáng)、巨噬細(xì)胞的集聚等有關(guān)[4-5]。

術(shù)后腦損傷是外科手術(shù)后常見的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為術(shù)后神經(jīng)系統(tǒng)炎癥及其導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙等，明顯影響患者術(shù)后恢復(fù)和生存質(zhì)量[6]。芬戈莫德(Fingolimod，F(xiàn)TY720)是1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate, S1P）類似物，通過激活SIP受體發(fā)揮獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能，是近年來備受關(guān)注的新型免疫調(diào)節(jié)劑[7-8]。FTY720作為S1P受體激動(dòng)劑，與S1P受體結(jié)合能抑制巨噬細(xì)胞向腎移植、高血壓腎病、過敏性結(jié)膜炎、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎、腦缺血再灌注等動(dòng)物模型的相應(yīng)組織浸潤，減輕炎性反應(yīng)[9-12]。FTY720除了作用于免疫系統(tǒng)外，還能穩(wěn)定地穿過血腦屏障，直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)S1P受體而發(fā)揮多重生物學(xué)效應(yīng)[13]?；诖?，本研究擬通過建立大鼠RIRI模型來探討FTY720能否改善大鼠術(shù)后腦損傷及其機(jī)制，相關(guān)的研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)雄性SD大鼠30只，體重 250~300g，由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK(川)2018-18，環(huán)境溫度21~25℃，自由進(jìn)食、進(jìn)水，采用隨機(jī)數(shù)字表法分3組（n=10）：假手術(shù)組（Sham）、模型組（RIRI組）和FTY720干預(yù)組（FTY720組）。

1.2 試劑與儀器

FTY720購自美國cayman公司，臨用時(shí)以生理鹽水配成濃度為1mg/ml注射液；Tunel試劑盒購自瑞士羅氏公司；兔源Caspase-3一抗1: 1000購自美國Abcam公司，β-actin一抗1: 1000購自美國Cell Signaling Technology公司，羊抗兔IgG二抗購自北京中杉公司，Morris水迷宮購自北京吉安得爾科技有限公司。

1.3 RIRI模型的制備及藥物注射方案

大鼠術(shù)前12h禁食，不禁水，以3%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉，皮膚消毒，經(jīng)背部雙側(cè)肋弓下緣距脊柱約0.5cm處行約長1.5cm的縱行切口，鈍性分離并暴露雙側(cè)腎臟，分離雙側(cè)腎蒂，切除右腎。Sham組僅暴露左側(cè)腎蒂，不阻斷；FTY720組和RIRI組大鼠采用無創(chuàng)動(dòng)脈夾阻斷左側(cè)腎蒂，可見腎臟由鮮紅變紫黑色，表示夾閉成功，阻斷45min后去除動(dòng)脈夾恢復(fù)腎血流。三組均以0.25%布比卡因分層浸入切口鎮(zhèn)痛，無菌絲線逐層縫合關(guān)腹，F(xiàn)TY720組于再灌注前15min通過腹腔注射FTY720（1 mg/kg），Sham組和RIRI組于再灌注前15min通過腹腔注射等體積生理鹽水。再灌注后經(jīng)腹腔補(bǔ)充林格氏液（3mL/100g，每小時(shí)1次），操作過程中維持動(dòng)物體溫在35.5℃~37℃。

1.4 標(biāo)本采集

術(shù)后24h每組隨機(jī)選取5只大鼠，水合氯醛腹腔麻醉，斷頭取出腦組織和左側(cè)腎臟，左側(cè)腦組織和左側(cè)腎臟分別置4%多聚甲醛中固定，右側(cè)腦組織剝離海馬組織后置于液氮罐保存。

1.5 HE染色觀察大鼠腎臟和海馬組織CA1區(qū)病理形態(tài)

大鼠腎臟組織和海馬組織經(jīng)浸洗、梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、切片( 4 μm) 、脫蠟、復(fù)水、染色等步驟后，于光鏡下觀察腎臟和海馬組織CA1區(qū)的病理形態(tài)，評(píng)價(jià)其病理性損傷。

1.6 TUNEL法測(cè)定大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

海馬組織按1.5項(xiàng)方法石蠟包埋、切片( 4 μm) 、脫蠟、復(fù)水等步驟后，加入20 μg?mL-1不含DNase的蛋白酶K試劑，于20~37℃下反應(yīng)15~30 min，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，加入TUNEL檢測(cè)試劑50 μL，于37℃避光孵育1 h；用PBS清洗3次，以封閉液封片后置于顯微鏡下觀察，記錄視野中TUNEL染色陽性細(xì)胞的數(shù)量。

1.7 Western blot檢測(cè)海馬組織Caspase-3表達(dá)水平

從液氮中取出各組海馬組織，稱量、研磨、裂解、離心、提上清，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將不同分子量蛋白分離，并將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。caspase-3、β-actin一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1h，清洗后滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑，曝光獲取圖像，使用ImageJ軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值比值表示。

1.8 Morris水迷宮檢測(cè)大鼠認(rèn)知功能

各組剩余大鼠于術(shù)后24h進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，參照文獻(xiàn)[14]。

實(shí)驗(yàn)指標(biāo): (1)定位航行實(shí)驗(yàn)，用于測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)能力：連續(xù)進(jìn)行5 d，每天1次，分別從四個(gè)象限中點(diǎn)將大鼠面向池壁入水，記錄每只大鼠從入水到爬上平臺(tái)的時(shí)間，即為逃避潛伏期，若60 s后大鼠仍未找到平臺(tái)，以60 s計(jì)算，并將其引導(dǎo)至平臺(tái)停留10s。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)，用于測(cè)試大鼠的空間記憶能力：第6 d進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺(tái)，選取和平臺(tái)對(duì)應(yīng)的象限中點(diǎn)入水，記錄60 s內(nèi)大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，兩組間比較采用最小差異法（LSD)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎臟組織的病理形態(tài)

光鏡下Sham組大鼠腎組織未見明顯病理改變，腎臟被膜完整，皮質(zhì)和髓質(zhì)分界清晰，其間可見少量炎細(xì)胞浸潤；RIRI組和FTY720組大鼠腎組織出現(xiàn)明顯病理改變，RIRI組腎臟皮質(zhì)出現(xiàn)片狀壞死，形成紅色淡染的透明物質(zhì)，皮質(zhì)和髓質(zhì)交界處腎小管和集合管灶狀壞死，結(jié)構(gòu)不清晰，腎小管和集合管中可見均質(zhì)紅染的蛋白樣物質(zhì)沉積；FTY720組腎臟出現(xiàn)局灶性壞死，腎小管上皮細(xì)胞脫落，呈均質(zhì)淡紅色物質(zhì)，皮質(zhì)和髓質(zhì)交界處大量的腎小管和集合管萎縮、變性和壞死，結(jié)構(gòu)不清晰，腎小管和集合管中可見粘液樣物質(zhì)沉積；以上結(jié)果說明大鼠腎缺血再灌注損傷模型造模成功，見圖1。

2.2 海馬組織CA1區(qū)病理形態(tài)

光鏡下，Sham組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，排列整齊；RIRI組海馬組織明顯水腫，椎體細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞變性壞死，F(xiàn)TY720組海馬病理變化較RIRI組明顯改善，病理學(xué)評(píng)分差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2、圖3。

圖3 各組大鼠海馬組織CA1病理評(píng)分比較（n=5）

2.3 TUNEL法測(cè)定海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況

Sham組偶見凋亡細(xì)胞，RIRI組可見較多TUNEL染色陽性，細(xì)胞核呈棕褐色的凋亡細(xì)胞；與 Sham 組比較，RIRI組大鼠大腦海馬組織CA1區(qū)凋亡細(xì)胞百分比明顯增加（P＜0.05）。與RIRI組比較，F(xiàn)TY720組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4、圖5。

圖4 各組大鼠海馬組織CA1 TUNEL染色陽性細(xì)胞

圖5 各組大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量比較（n=5）

2.4 Western blot 檢測(cè)海馬組織Caspase-3的表達(dá)水平

與 Sham組比較，RIRI組Caspase-3水平明顯增加（P＜0.05）；與RIRI組比較，F(xiàn)TY720組Caspase-3水平顯著降低（P＜0.05），如圖6、圖7所示。

圖6 各組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3蛋白的電泳圖

圖7 各組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（n=5）

2.5 大鼠的認(rèn)知功能

與Sham組相比，RIRI組大鼠逃逸潛伏期明顯延長，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與RIRI組相比，F(xiàn)TY720組大鼠逃逸潛伏期明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠逃逸潛伏期、穿越平臺(tái)指數(shù)比較（±SD，n=5）

表1 各組大鼠逃逸潛伏期、穿越平臺(tái)指數(shù)比較（±SD，n=5）

注：aP＜0.05 vs Sham group；bP＜0.05 vs FTY720 group

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3 討論

隨著腎移植技術(shù)的不斷提高，腎移植術(shù)后患者存活率不斷提高，術(shù)后認(rèn)知功能障礙正成為一個(gè)極其重要的臨床問題。FTY720作為FDA批準(zhǔn)的用來治療復(fù)發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化（MS）的口服免疫調(diào)節(jié)藥物，能通過血腦屏障，可作為用于臨床的具有神經(jīng)保護(hù)作用的潛在藥物，以減輕腎缺血再灌注對(duì)神經(jīng)認(rèn)知的影響。

本研究采用SD大鼠建立RIRI模型，結(jié)果顯示RIRI組大鼠腎組織和海馬組織CAI區(qū)出現(xiàn)了明顯的病理損傷，同時(shí)RIRI組大鼠海馬組織CA1區(qū)出現(xiàn)了大量的TUNEL染色陽性細(xì)胞，表明RIRI可導(dǎo)致大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，表明腎缺血再灌注引起腦損傷模型造模成功。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是目前公認(rèn)的客觀評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)記憶功能的實(shí)驗(yàn)方法，主要用于研究海馬損傷與空間學(xué)習(xí)記憶能力的關(guān)系[15]，本研究采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)研究RIRI對(duì)認(rèn)知功能的影響發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，RIRI組大鼠學(xué)習(xí)能力和空間記憶能力顯著降低，與Barbosa PR等人[16]的研究結(jié)果一致，提示RIRI能夠引起大鼠海馬組織CA1區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能障礙。術(shù)后認(rèn)知功能障礙的確切機(jī)制仍不明確，其中手術(shù)創(chuàng)傷引起的組織損傷激活機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β[17-18]等大量釋放是重要原因。細(xì)胞因子能夠在相對(duì)薄弱的室周區(qū)，以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式穿過血腦屏障進(jìn)入大腦，細(xì)胞因子也可刺激迷走神經(jīng)傳入纖維，進(jìn)而激活中樞炎性反應(yīng)通路，上述兩種途徑導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步合成和釋放TNF-α、IL-6、IL-1β，細(xì)胞因子和小膠質(zhì)細(xì)胞活化共同造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。但仍有研究表明[19-20]，F(xiàn)TY720能為病理環(huán)境中的神經(jīng)元提供神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，主要是通過上調(diào)神經(jīng)元細(xì)胞上Bcl-2/Bax蛋白的結(jié)合率，下調(diào)凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)水平，從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡效應(yīng)，有效改善認(rèn)知功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720組大鼠海馬組織CA1區(qū)病理損傷、神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)顯著低于RIRI組，提示FTY720對(duì)RIRI大鼠腦組織損傷有保護(hù)作用，且水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)TY720組大鼠學(xué)習(xí)能力和空間記憶能力較RIRI組有顯著改善，提示FTY720能夠一定程度地改善RIRI引起的大鼠認(rèn)知功能障礙。Western blot結(jié)果顯示，與RIRI組相比，F(xiàn)TY720組大鼠海馬組織CA1區(qū)Caspase-3的表達(dá)水平顯著降低，提示FTY720可通過下調(diào)海馬組織CA1區(qū)Caspase-3的表達(dá)從而發(fā)揮抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，與Di Menna L[20]等人研究結(jié)果相一致。

綜上所述，RIRI造模大鼠可引起遠(yuǎn)隔器官腦組織的損傷和認(rèn)知功能障礙，F(xiàn)TY720干預(yù)能顯著改善大鼠RIRI引起的腦損傷和認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能與FTY720抑制Caspase-3的表達(dá)，從而減少海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究為FTY720作為腎缺血再灌注引起腦損傷的潛在治療藥物提供了一定的基礎(chǔ)。