靳 燕，王謝琴，卿 華，馬 政，姚慧鵬

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安 625014）

黃瓜（Cucumis sativus L.）葫蘆科一年生蔓生或攀緣草本植物，是我國的主要蔬菜作物之一，具有重要的醫(yī)藥、營養(yǎng)和食療價(jià)值。隨著人民生活水平的不斷提高，對食品質(zhì)量的追求逐步升高，因此，研究黃瓜抗逆育種對培育品質(zhì)優(yōu)良的黃瓜品種，進(jìn)而推動黃瓜農(nóng)業(yè)種植生產(chǎn)具有現(xiàn)實(shí)意義。

鈣依賴性蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinase，CDPKs）是一種直接利用ATP激活的蛋白質(zhì)底物以及Ca2+作為信號的酶，主要存在于植物和原生動物中[1]。典型的CDPK分子由1條多肽鏈組成，從N端到C端存在4個功能區(qū)（結(jié)構(gòu)域），從N端到C端依次為可變結(jié)構(gòu)域（variable N-terminal domain，VNTD）、Ser/Thr蛋白激酶域（Ser/Thr protein kinase domain，PKD）、自抑制連接域（junction domain，JD）和C端具有EF手型結(jié)構(gòu)的類鈣調(diào)素調(diào)控結(jié)構(gòu)域（CaM-like regulatory domain，CaMLD）[2]。CDPK 在植物體內(nèi)廣泛分布，并在植物碳/氮代謝、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、氣孔運(yùn)動調(diào)節(jié)和生長發(fā)育調(diào)節(jié)等均發(fā)揮一定作用[3]，另外，其在植物對抗生物脅迫與非生物脅迫中也起著重要作用[4-5]。CDPK基因作為古老的基因家族，在原生生物如剛地弓形蟲[6]（Toxoplasma gondii），早期低等植物如鹽藻（Dunaliella salina）[7]中都有發(fā)現(xiàn)，因此CDPK基因是作為研究植物基因進(jìn)化的理想對象。

本文用生物信息學(xué)方法，在黃瓜的全基因組范圍內(nèi)鑒定出17個CsCPKs基因并分析其結(jié)構(gòu)、染色體分布、進(jìn)化關(guān)系及功能域。以期為深入探索黃瓜CDPK蛋白生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

從在線網(wǎng)站 Ensembl（http：//plants.ensembl.org/index.html）中下載黃瓜基因組數(shù)據(jù)以及從Pfam數(shù)據(jù)庫中下載 CDPK特征文件 PF00069（kinase）、PF00036（CaM-LD）和 PF13499（EF-hand），后 在Linux系統(tǒng)中利用進(jìn)行hmmer搜索第一次鑒定基因家族（設(shè)定閾值為E＜1e-5）。在此基礎(chǔ)上選擇匹配更好的候選序列，進(jìn)行特殊隱馬爾可夫模型的構(gòu)建。然后進(jìn)行第二次hmmer搜索鑒定（設(shè)定閾值為E＜1e-5）。之后篩選數(shù)據(jù)借助在線網(wǎng)站SMARTSMART（http：//smart.embl.de/）NCBI CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）Pfam（http：//pfam.xfam.org/）確認(rèn)候選基因結(jié)構(gòu)完整性和結(jié)構(gòu)域保守性，剔除冗余序列得到17個CsCPKs序列。

1.2 試驗(yàn)方法

對鑒定出的所有基因序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，在GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）獲得黃瓜 CDPK的內(nèi)含子和外顯子數(shù)量及位置、在軟件Mapchart上繪制基因在染色體上的分布情況。通過軟件CSSPalm 3.0預(yù)測黃瓜CDPK蛋白氮端結(jié)構(gòu)域是否能進(jìn)行十六烷酰化。在線軟件MEME（http：//meme-suite.org/）探測CDPK中保守的motifs，同時(shí)在InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）軟件搜索不同的 motif所對應(yīng)的不同功能[8]。利用下載好的無油樟（Amborella trichopoda）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）和葡萄（Vitis vinifera）等植物和黃瓜的CDPK編碼蛋白序列進(jìn)行多序列比對后，利用MEGA7.0，采用鄰接法（neighbor joining，NJ），校驗(yàn)參數(shù) Bootstrap 重復(fù)1 000次，構(gòu)建無根系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)而推測CDPK基因的進(jìn)化過程。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜CDPK基因家族的鑒定及其基本特征研究

通過兩次進(jìn)行hmmer搜索鑒定，黃瓜基因組包含了17條CDPK基因，這17條CDPK基因都包含STKD結(jié)構(gòu)域和CaM-LD結(jié)構(gòu)域以及EF手結(jié)構(gòu)（圖1）。黃瓜CDPK基因特征表現(xiàn)和在7條染色體上的位置見圖2、3。并根據(jù)黃瓜CDPK基因在染色體上的排列順序，將17條黃瓜CDPK基因命名為CsCPK1-17。

圖1 黃瓜CDPK基因結(jié)構(gòu)域Figure 1 Cucumber CDPK gene domain

2.2 黃瓜CsCPKs的進(jìn)化分析

將黃瓜CDPK與在NCBI下載的無油樟Atr-CPKs、擬南芥AtCPK和葡萄VvCPKs基因序列構(gòu)建最大似然進(jìn)化樹，可以看到黃瓜CDPK基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。這17條CsCPKs根據(jù)擬南芥CDPKs的分類可以分為 A、B、C和 D 4個亞家族，A1、A2、A3、B1、B2、B3、B4、C1、C2、C3、C4 和 D 12 個超亞家族，在4個超亞家族中，D亞家族所含有的黃瓜CDPK最少。同樣的，也可以將葡萄VvCPKs分為4個亞家族，12個超亞家族（圖2）。同源的CsCPK位于染色體 1、3、4、6、7 上，而染色體 2 上無同源CsCPKs，這可能是多倍體事件發(fā)生之后，來源同一染色體的序列發(fā)生了丟失（圖3），導(dǎo)致出現(xiàn)了同源CsCPKs。

圖2 擬南芥、無油樟、葡萄和黃瓜CDPK基因家族拓?fù)錁銯igure 2 Topological tree of CDPK gene family in Arabidopsis，oil-free camphor，grape and cucumber

圖3 CDPK基因在黃瓜染色體上的分布Figure 3 Distribution of CDPK gene on cucumber chromosome

2.3 CsCPK中的結(jié)構(gòu)差異

無論是在水稻還是在葡萄對CDPK的研究中，CDPKs的內(nèi)含子對進(jìn)化都十分重要。在水稻和葡萄中，D家族的內(nèi)含子數(shù)量是最多的，這可能在進(jìn)化過程中發(fā)生了內(nèi)含子丟失事件，導(dǎo)致A、B和C家族的內(nèi)含子數(shù)量減少。而在對CsCPKs的轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)分析來看，位于D家族的CsCPK的內(nèi)含子數(shù)目與其他亞家族的內(nèi)含子數(shù)目相差不大，都在6～8之間，證明黃瓜CDPK在進(jìn)化過程中可能沒有發(fā)生內(nèi)含子丟失事件或者在此之前就早已發(fā)生了內(nèi)含子的丟失（圖 4，表 2）。

圖4 17條CDPK基因內(nèi)含子和外顯子的基因結(jié)構(gòu)Figure 4 Gene structure of 17 CDPK gene introns and exons

表1 CsCPKs的基因特征Table 1 Gene features of CsCPKs

表2 17條CDPK基因內(nèi)含子和外顯子的數(shù)量Table 2 Number of introns and exons of 17 CDPK genes

根據(jù)在Css-palm3.0得到的結(jié)果表3來看，能進(jìn)行棕櫚酰化的CsCPKs除CsCPK3之外其余的CsCPKs都具有棕櫚?；稽c(diǎn)，證明這些CsCPKs基因都與膜功能相關(guān)。李靜等[9]研究中發(fā)現(xiàn)，在梨樹和擬南芥CDPK的進(jìn)化樹中，PbCDPK5和PbCDPK7與AtCPK10和AtCPK30的親緣關(guān)系最為接近，發(fā)現(xiàn)PbCDPK5和PbCDPK7與AtCPK10和AtCPK30一樣都與逆境脅迫下的信號傳導(dǎo)有關(guān)，證明了通過構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行對比分析可以預(yù)測一定的功能。而根據(jù)表2發(fā)現(xiàn)CsCPK9和VvCPK4最為接近，推測CsCPK9可能與VvCPK4一樣在生殖和發(fā)育方面起作用。

表3 N端能進(jìn)行十六烷?；腃DPK基因Table 3 CDPK gene with N-terminal cetyl acylation

通過在MEME上對黃瓜CDPK蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域掃描，搜索到了16個保守的motif。根據(jù)圖5結(jié)果來看，所有的CsCPKs都具有motif1～10、motif12和motif14，這些motif構(gòu)成了CDPK典型的結(jié)構(gòu)域，而只有位于C亞家族的CsCPKs具有motif16（包括B家族的CsCPK15）和motif11，位于D亞家族的CsCPK12無 N 端的 motif3、motif13、motif14和 motif15，這可能是CsCPK12在進(jìn)化過程中，N端發(fā)生了退化。根據(jù)在InterProScan搜索不同的motif所具有的不同功能，motif11和motif13與調(diào)節(jié)滲透性和鹽度耐受性有關(guān)，motif15與植物生長發(fā)育有關(guān)，motif16與膜功能相關(guān)。經(jīng)InterProScan對CsCPKs結(jié)構(gòu)域搜索分析，所有的CsCPKs都具有ATP結(jié)合，Ca2+結(jié)合，蛋白激酶活性的分子功能，參與蛋白質(zhì)磷酸化的生物過程，特有的motif決定了某些CsCPKs特有的生物學(xué)功能[8.10]。

圖5 17條CsCPKs不同的motif組成Figure 5 17 CsCPKs composed of different motifs

3 討論和結(jié)論

研究CDPKs的進(jìn)化對了解植物抗逆作用機(jī)制有著重大的影響，此前F.Marianna等[11]分析到葡萄CDPKs基因分為4個亞家族，12個超亞家族，在進(jìn)化的過程中發(fā)生了13次基因組加倍事件，3次大型全基因組復(fù)制事件。CDPK最早是存在于衣藻中，隨著基因組的擴(kuò)張，逐步出現(xiàn)在裸子植物，被子植物當(dāng)中。不僅如此，葉水烽博士根據(jù)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)水稻中的CDPKs也分別處于4個亞家族當(dāng)中，第四亞家族中的CDPKs的內(nèi)含子個數(shù)明顯比其他族的多，且衣藻的兩個CDPK基因都位于這一組，可以得出第四亞家族是最早擴(kuò)張出來的[12]。我們不僅可以通過與擬南芥葡萄構(gòu)建進(jìn)化樹來分析黃瓜CDPK的進(jìn)化情況，還可以通過內(nèi)含子和外顯子的分布情況來分析黃瓜CDPK基因進(jìn)化的先后順序。張進(jìn)等[13]對楊樹CDPK基因與擬南芥CDPK基因做同源性分析，也將楊樹的CDPK基因分為4個家族，且第四家族的基因數(shù)最少。

研究CDPKs的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化史對了解植物的功能有著重大的影響，F(xiàn)asoli Marianna等[11]通過對17個葡萄CDPK基因進(jìn)行motifs探測，發(fā)現(xiàn)催化區(qū)由motif6、motif3、motif1和motif4組成，連接區(qū)和結(jié)構(gòu)區(qū)由motif2和motif5組成，可變區(qū)中只有A1家族含有motif9，其他的葡萄CDPK如VvCPK7等的可變區(qū)中未探測到motif，猜測VvCPK7可能發(fā)生了變性或存在不保守序列。不同的motifs對應(yīng)不同的功能，這暗示了葡萄CDPK功能的多樣性。J.Sheen[14]發(fā)現(xiàn)，在干旱和鹽誘導(dǎo)條件下，擬南芥AtCPK1和AtCPK2的表達(dá)量顯著增加，擬南芥AtCPK10和AtCPK30參與了對ABA和非生物脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在梨樹和擬南芥CDPK的進(jìn)化樹的研究中，李靜等[9]發(fā)現(xiàn)PbCDPK5和 PbCDPK7與AtCPK10和AtCPK30的親緣關(guān)系最為接近，就猜測PbCDPK5和PbCDPK7與逆境脅迫下的信號傳導(dǎo)有關(guān)。經(jīng)過Q-PCR試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在干旱處理8 h后，PbCDPK5和PbCDPK7含量升高，證明了通過構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行對比分析可以預(yù)測一定的功能。

由于最早分化出來的綠藻中很少有CDPKs基因，因此黃瓜CDPKs的形成必然經(jīng)歷了多次基因組擴(kuò)張事件[15]。在植物的CDPKs進(jìn)化史中，發(fā)生了3次大型基因組復(fù)制事件[10，16-17]，分別是距今4億年至3億年前的ζ全基因翻倍，距今3億年至2億年前的ε全基因翻倍以及距今大約1億1 700萬年前的γ全基因翻倍。D家族的起源最早，最早為單一基因家族，后經(jīng)ζ全基因翻倍出現(xiàn)了B1、B2、C1和C2超亞家族，ζ基因組擴(kuò)張事件發(fā)生在維管植物出現(xiàn)之后，種子植物出現(xiàn)之前。ε全基因翻倍事件的發(fā)生導(dǎo)致了B3、B4、C3和C4超亞家族的產(chǎn)生，且ε全基因翻倍事件發(fā)生在種子植物出現(xiàn)之后，被子植物出現(xiàn)之前。γ全基因翻倍事件的發(fā)生導(dǎo)致了VvCPK9、13，VvCPK12、17，VvCPK5、11 的出現(xiàn)，通過黃瓜CDPK基因家族與葡萄CDPK基因家族構(gòu)建的拓?fù)錁鋪砜?，CsCPK6出現(xiàn)在VvCPK9之后，CsCPK4和CsCPK15 出現(xiàn)在 VvCPK12、17 之后，CsCPK2、11、14出現(xiàn)在VvCPK5、11之后，證明γ全基因翻倍事件產(chǎn)生了 CsCPK2、4、6、11、14 和 15（圖 2）。在 3 次基因組擴(kuò)張事件發(fā)生之后，無其他基因組擴(kuò)張事件的發(fā)生，證明CsCPKs至少出現(xiàn)在1億年前，而異源多倍體化事件發(fā)生在6 500萬年前左右[18]，CsCPKs的進(jìn)化史并不支持異源多倍體事件促進(jìn)CsCPK進(jìn)化的理論，而支持由基因組擴(kuò)張事件引起進(jìn)化的理論。如果CsCPKs發(fā)生了異源多倍體化，那么CsCPKs肯定經(jīng)過徹底的純化選擇作用。

CDPKs基因廣泛存在于各種植物中，通過對黃瓜CDPKs的研究，發(fā)現(xiàn)黃瓜具有17條CDPKs，且在4個亞家族中均有分布，在目前對已測序的葫蘆科植物的研究中，西瓜和甜瓜的CDPKs分別有22條和18條[9，19]，黃瓜的CDPKs數(shù)目與甜瓜的最為接近，全基因組復(fù)制事件導(dǎo)致CDPK基因家族在不同的物種中數(shù)目出現(xiàn)差異[20]。

我們看到黃瓜的CDPK基因組出現(xiàn)在VvCDPK之前或在VvCDPK基因之后分成新基因，我們可以推測黃瓜的出現(xiàn)應(yīng)該早于葡萄。隨著對黃瓜的研究，我們可能會挖掘更多的黃瓜同源CDPK基因，并可能逐漸了解到CsCPKs基因是如何在逆境條件下響應(yīng)的以及在黃瓜生長發(fā)育過程中是扮演的什么樣的角色。