宋云飛

作者單位：遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥學部，遼寧 沈陽110032

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)包括記憶障礙、失語失認、視空間能力和抽象計算能力損傷等。據(jù)2016 年的調(diào)查問卷顯示全球約有4 千萬人患有AD，且65 歲以上的老年人的發(fā)病率在4%～8%左右。隨著人口老齡化進程的加快，開發(fā)治療AD的藥物已成為我國醫(yī)藥行業(yè)的重中之重。

右美托咪定（DEX）是一種相對選擇性的α2-腎上腺素受體激動劑，適用于行全身麻醉的手術患者氣管插管和機械通氣時的鎮(zhèn)靜，同時還有抗交感、抑制應激反應、穩(wěn)定血流動力學以及減少麻醉劑用量的作用。最新研究證明DEX 可抑制SIRT1 信號通路從而減少大鼠手術后的認知功能障礙的風險。而且，DEX 能抑制炎性因子的釋放，發(fā)揮神經(jīng)保護作用，從而改善老年大鼠認知功能障礙。但是DEX 是否對APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠的認知功能障礙有改善作用且是否能抑制海馬區(qū)神經(jīng)細胞炎癥浸潤以及凋亡還未見報道，所以本研究自2018 年3 月至2019 年3 月以APP/PS1 小鼠模型模擬AD，觀測不同劑量DEX 對其海馬區(qū)神經(jīng)細胞的保護作用，為臨床上治療阿爾茨海默病提供一定的基礎理論和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

野生型SPF級C57BL/6小鼠購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，許可證號SCXK（蘇）2017-0001；APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因C57BL/6 小鼠購自南京大學模式動物研究所，合格證號SXK（蘇）2010-0021。所有被安置在一個符合SPF級標準的動物房間里，籠3～4 只小鼠，溫度18～24 ℃，相對濕度55%～65%，每日光照或黑夜均為12 h，可自由取用食物和水。所有本研究中使用的實驗方案得到了實驗動物福利倫理委員會的批準。

1.2 試劑

鹽酸右美托咪定購自江蘇瑞恒醫(yī)藥股份有限公司；4-苯基丁酸（PBA）購自Sigma 公司；鼠抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-3）購自Proteintech公司，兔抗B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白（Bax）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白（CHOP）購自Cell signaling technology公司；Nissl染色液和TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術有限公司；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒及蛋白上樣緩沖液購自碧云天生物技術研究所；白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）及腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒購自江蘇科特生物有限公司。

1.3 儀器

Morris 水迷宮系統(tǒng)（贊德儀器有限公司）；冰凍切片機（HM525，北京華興科儀科技發(fā)展有限公司）；倒置熒光生物顯微鏡（FM-500，上海普丹），WB電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）。

1.4 分組與治療

取7 月齡APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠，隨機分為模型組（TG）、DEX 低劑量組（TG+10 μg/kg DEX）、DEX 高劑量組（TG+20 μg/kg DEX）和PBA 陽性對照組（TG+400 mg/kg PBA），另取野生型C57BL/6 小鼠作為對照組（WT），每組6 只。每天腹腔注射DEX 一次，連續(xù)治療4 周，TG 組和WT 組給予等量的0.9%氯化鈉溶液。

1.5 水迷宮檢測各組小鼠的學習記憶能力

治療結(jié)束后，各組小鼠進行定位航行實驗，實驗共進行5 d（訓練階段+正式實驗階段），記錄小鼠找到平臺所需的時間（即為小鼠逃避潛伏期）并保存小鼠游泳軌跡圖。第6天將平臺撤除，進行空間探索實驗。將小鼠從原平臺所在象限的對側(cè)頭朝池壁緩慢放入水中，記錄其60 s 內(nèi)的游泳軌跡以及穿越平臺的次數(shù)，并對所得數(shù)據(jù)進行比較分析。

1.6 Nissl 染色觀測小鼠腦內(nèi)海馬神經(jīng)細胞的數(shù)量

水迷宮實驗結(jié)束后，將小鼠麻醉，4%多聚甲醛溶液心臟灌流，快速取出完整的腦組織，將其放入4%多聚甲醛溶液中固定，隨后將其包埋于冰凍切片專用包埋劑中，置于-80 ℃超低溫冰箱中冷凍24 h，次日，進行連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚4 μm。行Nissl染色：將小鼠腦冰凍切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇溶液中進行脫脂處理30 s，雙蒸水洗滌切片3 次，每次30 s；將切片浸入甲酚紫染液，56 ℃染色1 h，雙蒸水洗滌3 次，每次30 s；中性分色液分色2 min，浸入100%乙醇中30 s，浸入二甲苯透明1 min，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 TUNEL 法檢測各組小鼠海馬區(qū)細胞凋亡的影響

4%多聚甲醛固定小鼠腦切片30 min，PBS 洗滌；1%Triton X-100 透化5 min，PBS 洗滌；每個腦組織滴加50 μL TdT 酶反應液，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗滌；隨后每個腦組織滴加50 μL熒光標記液，37 ℃避光孵育0.5 h，PBS 洗滌；DAPI 染色液進行細胞核染色，避光孵育10 min，PBS 洗滌；置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 ELISA 檢測小鼠海馬中IL

-

1

β

、IL

-

6 及TNF

-α

的含量

酶聯(lián)免疫吸附劑測定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）檢測各組小鼠海馬組織勻漿中IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.9 Western Blot 檢測小鼠海馬中凋亡相關蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白表達情況

提取各組小鼠海馬組織總蛋白，使用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量并統(tǒng)一濃度，加入蛋白上樣緩沖液并加熱煮沸使蛋白變性，隨后先后進行SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育及顯色后，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，測定光密度。一抗與二抗稀釋濃度均為1∶1 000。采用目的條帶與內(nèi)參蛋白條帶光密度比值作為結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

1.10 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進行分析處理。數(shù)據(jù)表示為x ± s，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用LSD-t 法，以P ＜0.05作為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DEX 改善APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠學習與記憶

能力

Morris 定位航行實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過5 d 的定位航行訓練，最后一天實驗中WT 組潛伏期最短為（8.35±2.24）s，TG 組的潛伏期最長為（28.63±3.87）s，兩者相比差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01），而給予了低高劑量DEX 和PBA 的TG 小鼠與TG 組相比，潛伏期 明 顯 縮 短 為（19.56±5.94）s、（14.52±4.03）s 和（12.75±3.51）s（P ＜0.01），說明DEX 能提高APP/PS1小鼠的學習能力。

空間探索實驗結(jié)果顯示，WT 組平均穿越平臺次數(shù)（6.50±1.04）次，TG 組平均穿越平臺（3.0±0.89）次，兩者相比差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01），而給予了低高劑量DEX 和PBA 的TG 小鼠與TG 組相比，穿越平臺次數(shù)明顯增多為（3.5±1.05）s、（5.5±1.05）s 和（5.83±1.17）s，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；不同組間均數(shù)比較，F(xiàn)=12.835，P＜0.001，說明DEX 能提高APP/PS1小鼠的記憶能力。見表1和圖1。

2.2 DEX 明顯增多APP/PS1 小鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量

Nissl 染色結(jié)果顯示，WT 組小鼠海馬區(qū)尼氏小體排列緊密，數(shù)量較多，而TG 組海馬區(qū)尼氏小體數(shù)量明顯減少；給予DEX 治療的APP/PS1 小鼠海馬區(qū)尼氏小體數(shù)量明顯增多，說明DEX 明顯增多APP/PS1小鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量（圖2）。

2.3 DEX 抑制APP/PS1 小鼠海馬區(qū)細胞的凋亡

與WT 組相比，TG 組小鼠海馬區(qū)細胞凋亡數(shù)顯著增多（183.67±20.32）個/毫米TG 比（17.17±6.74）個/毫米WT（P＜0.01）。與TG 組相比，低高劑量DEX 組和PBA 組小鼠海馬區(qū)細胞的凋亡數(shù)明顯減少至（139.0±16.44）個/毫米，（112.67±13.79）個/毫米和（108.67±16.80）個/毫米（P ＜0.01），且不同組間均數(shù)比較，F(xiàn)=92.830，P＜0.001，說明DEX 可以抑制TG小鼠海馬區(qū)細胞的凋亡。見圖3。

2.4 DEX 降低APP/PS1 小鼠海馬IL

-

1

β

、IL

-

6 及TNF

-α

含量

與WT 組相比，APP/PS1 小鼠海馬區(qū)IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）；而經(jīng)DEX 和PBA 治療后，APP/PS1小鼠海馬區(qū)促炎因子IL-1β、IL-6及TNF-α 水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01），說明DEX 能夠抑制APP/PS1小鼠海馬區(qū)炎癥反應（表2）。

2.5 DEX 抑制APP/PS1 小鼠海馬區(qū)凋亡蛋白的表達

與WT 組相比，TG 組Bax/Bcl-2 比例和活化的caspase-3（cleaved caspase-3）表 達 量明顯增加 至（3.43±0.68）和（2.77±0.40），差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）；低高劑量DEX 和PBA 組能降低Bax/Bcl-2 比例和活化的caspase-3 的相對表達，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01），且不同組間均數(shù)比較，F(xiàn)=17.956，P＜0.001（Bax/Bcl-2 比例），F(xiàn)=25.676，P＜0.001（cleaved caspase-3）；說明DEX 通過抑制TG 小鼠海馬區(qū)Bax/Bcl-2 比例和caspase-3 的活化發(fā)揮抗凋亡作用。電泳圖見圖4。

圖4 WB檢測各組小鼠海馬區(qū)凋亡相關蛋白的表達

2.6 DMED 降 低APP/PS1 小 鼠 海 馬GRP78 和CHOP 蛋白的表達

與WT 組相比，TG 組GRP78 和CHOP 表達量明顯增加，增加至2 倍以上，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）；低高劑量DEX 和PBA 組能降低GRP78 和CHOP 的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01），說明DEX通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白的表達發(fā)揮抗炎抗凋亡作用。見表3和圖5。

表1 各組小鼠定位航行實驗逃避潛伏期結(jié)果/（s，±s）

表2 各組小鼠海馬區(qū)炎性因子的表達/±s

表3 各組小鼠海馬區(qū)GRP78和CHOP蛋白的表達/±s

圖5 各組小鼠海馬區(qū)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白(CHOP)表達

3 討論

阿爾茨海默?。ˋD）是一種進行性中樞神經(jīng)退行性疾病，其特征是記憶力受損和認知功能受損。AD 的主要臨床特征是精神和行為功能逐漸下降引起的精神喪失、失認、失語、失用癥和情緒失調(diào)。其主要病理特征是淀粉樣斑塊、神經(jīng)原纖維纏結(jié)及神經(jīng)元丟失等。目前AD 的發(fā)病機制尚不明確，可能是環(huán)境、生活方式及遺傳因素相互作用的結(jié)果。盡管科學家們竭盡全力地研究AD 的防治方法，但很少有有效的治療方法，這給人類和社會帶來越來越大的負擔。在針對AD 尋找有效治療方法的失敗使我們意識到了對AD 發(fā)病機制的認識不足。本研究采用7 月齡的APP/PS1 小鼠作為AD 模型研究，采用定位航行實驗和空間探索實驗檢測DEX 對其學習與記憶能力。實驗結(jié)果（表1和圖1）發(fā)現(xiàn)與WT組相比，TG 組小鼠經(jīng)歷了更久的逃避潛伏期，并且穿越平臺的次數(shù)顯著減少；而給予DEX 腹腔治療的TG小鼠不僅能夠縮短平均逃避潛伏期，而且延長其穿越平臺的次數(shù)。因此，我們得出DEX 能夠提高TG 小鼠的空間學習與記憶能力，且與劑量呈依賴性。

眾所周知，海馬是調(diào)控大腦的學習記憶以及認知功能的重要區(qū)域，當海馬神經(jīng)元被破壞后，其學習和記憶功能必將紊亂。生理狀態(tài)下，腦內(nèi)微環(huán)境處于一個自我調(diào)控的穩(wěn)定狀態(tài)，腦內(nèi)微環(huán)境一旦受到外來或自身性損傷，處于靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞被激活，清除致病因子以及凋亡的神經(jīng)細胞從而發(fā)揮著免疫作用與營養(yǎng)作用。在AD 腦中，小膠質(zhì)細胞可以遷移到斑塊附近，釋放一些抗炎因子，如IL-4、10及13等來調(diào)節(jié)腦內(nèi)微環(huán)境。但是這些小膠質(zhì)細胞沒有降解Aβ 的能力，反而產(chǎn)生的慢性炎性反應對其附近的神經(jīng)細胞造成嚴重損傷。體外研究發(fā)現(xiàn)Aβ 可激活小膠質(zhì)細胞進而誘導促炎性因子的釋放，包括炎性因子IL-1、2、6、8、TNF-α 等，導致神經(jīng)細胞損傷乃至死亡，造成一種神經(jīng)細胞受損和Aβ 沉積的惡性循環(huán)?？茖W家通過比較AD患者和正常人的血樣發(fā)現(xiàn)，AD 患者腦脊液和血漿中IL-6 水平升高，而腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體水平降低，說明炎癥反應在AD 發(fā)病過程中持續(xù)存在。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與WT 組小鼠相比，TG小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)尼氏小體數(shù)目明顯減少，TUNEL 陽性細胞數(shù)明顯增加，而給予DEX 后TG 小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)尼氏小體顯著增多，TUNEL 陽性細胞數(shù)明顯減少，且Bax/Bcl-2 的比值以及活化的Caspase-3 的表達顯著降低，這些證據(jù)都說明DEX 能抑制細胞凋亡，促進神經(jīng)元的存活。在此基礎上，我們用ELISA法檢測了各組小鼠海馬區(qū)相關炎性因子的表達。表2 結(jié)果顯示TG 小鼠海馬區(qū)IL-1β、IL-6 和TNF-α的含量較WT 組明顯升高，DEX 治療后IL-1β、IL-6和TNF-α 增強的作用被逆轉(zhuǎn)，這些都充分的說明了DEX 對炎癥反應的抑制作用，也進一步說明了DEX通過減少腦內(nèi)海馬區(qū)炎性因子的表達，促進神經(jīng)元的存活發(fā)揮治療AD的作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞內(nèi)一個承擔著重要生理功能的細胞器，為蛋白質(zhì)的合成、折疊、運輸和細胞內(nèi)鈣的儲存提供了主要的場所。當細胞受到一些內(nèi)外界刺激（缺氧缺血、營養(yǎng)過?；蛉笔А⒀趸瘧?、病毒感染、基因突變等）時，都有可能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鈣離子通道的改變，出現(xiàn)鈣剝奪或鈣超載，進而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，導致正常蛋白質(zhì)的合成能力不足，而錯誤蛋白質(zhì)折疊增多，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ERstress）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應首先啟動細胞內(nèi)的生存途徑——未折疊蛋白質(zhì)響應（unfolded protein response，UPR），通過加強蛋白質(zhì)正確的折疊，清除錯誤折疊蛋白質(zhì)，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)恢復平衡。具體效應主要是堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的未折疊蛋白質(zhì)或錯誤折疊的蛋白質(zhì)作為信號，活化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上伴侶基因蛋白（GRP78），使GRP78 與膜上蛋白解離，優(yōu)先與未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，使其正確折疊，使細胞適應ER stress。但強烈持續(xù)的ER-stress反應將啟動細胞的凋亡途徑來清理這些“妥協(xié)的細胞”，如CHOP蛋白是ER-stress誘導產(chǎn)生的凋亡信號分子，是ER-stress 細胞凋亡反應的直接結(jié)果。所以本研究以GRP78 和CHOP 表達為指標檢測DEX 治療AD 的機制，結(jié)果顯示TG 小鼠海馬區(qū)GRP78 和CHOP 的表達較WT 組明顯升高，DEX 治療后GRP78和CHOP增強的作用被抑制。為了進一步證實DEX 對AD 的治療效果，我們采用了ERstress 的抑制劑PBA 作為陽性對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量DEX與PBA的治療效果相當。

綜上所述，DEX 可以改善TG 小鼠學習與記憶能力，并且證實DEX 是通過抑制腦內(nèi)海馬區(qū)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，從而減輕炎癥反應，抑制神經(jīng)細胞的凋亡促進神經(jīng)元存活發(fā)揮治療作用，但是其具體作用機制仍需進一步研究。為治療AD 等神經(jīng)退行性疾病開辟了新的途徑，具有廣闊的臨床應用前景和重大的社會經(jīng)濟價值。

（本文圖1～3見插圖2-2）