戴秋陽 湯米 張培炎 包小峰 陳勇

摘 要 目的：建立測定大鼠血漿和腦組織中司替戊醇（STP）質(zhì)量濃度的方法，并比較STP及其自納米乳在血漿、腦組織中的藥物濃度。方法：以占噸酮為內(nèi)標，采用高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FLR）測定。色譜柱為Diamonsil C18，流動相為乙腈-25 mmol/L KH2PO4水溶液[44 ∶ 56（V/V），pH 2.6]，流速為1.5 mL/min，激發(fā)波長為210 nm，發(fā)射波長為400 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。將36只大鼠隨機分為兩組，每組18只，分別灌胃STP自納米乳和STP混懸液（40 mg/kg，均以STP計）。于給藥后0.5、1、2 h時采集大鼠血液和腦組織樣品（各時間點每組各6只），經(jīng)乙腈沉淀蛋白（腦組織需先進行勻質(zhì)）等處理后，采用上述色譜條件檢測STP的質(zhì)量濃度并比較。結(jié)果：STP在血漿、腦組織中藥物濃度檢測的線性范圍均為0.02～8.00 μg/mL（r分別為0.999 6、0.999 4），定量下限均為0.02 μg/mL;日內(nèi)、日間RSD均小于5%，提取回收率和方法回收率均不低于90%。與STP混懸液組比較，STP自納米乳組大鼠各時間點的血藥濃度（給藥后1 h除外）、腦組織中藥物濃度（給藥后2 h除外）均顯著升高（P<0.05），且兩者（以STP自納米乳為對象）具有明顯的線性關(guān)系。結(jié)論：所建HPLC-FLR法的靈敏度、精密度較高，可用于研究STP及其自納米乳在大鼠血漿和腦組織中的分布情況;將STP制成自納米乳后，其在血漿、腦組織中的藥物濃度明顯提高。

關(guān)鍵詞 司替戊醇;自納米乳;高效液相色譜-熒光檢測法;體內(nèi)藥物分布;血漿;腦組織

中圖分類號 R969.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）03-0273-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.03.04

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for determining stiripentol （STP） concentration in plasma and brain of rats， and to compare the concentrations of STP and its self-nanoemulsifying drug delivery system （STP-SNEDDS） in plasma and brain. METHODS： Using xanthone as internal standard， HPLC-fluorescence （HPLC-FLR） method was adopted. The determination was performed on Diamonsil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-25 mmol/L KH2PO4 solution [44 ∶ 56（V/V）， pH 2.6] at a flow rate of 1.5 mL/min; the excitation and emission wavelengths were 210 nm and 400 nm， respectively; the column temperature was 30 ℃; the sample size was 10 μL. Totally 36 rats were randomly divided into 2 groups， with 18 rats in each group. They were given STP-SNEDDS and STP suspension （40 mg/kg， by STP） intragastrically. Blood and brain tissue samples were collected at 0.5， 1， 2 h after administration （6 rats in each group at different time point）. After the protein was precipitated by acetonitrile （brain tissue should be homogenized）， the concentrations of STP were determined by the above chromatographic conditions. RESULTS： The linear ranges of STP concentration in plasma and brain tissue were 0.02-8.00 μg/mL （r were 0.999 6， 0.999 4， respectively）. The limits of quantitation were both 0.02 μg/mL. The inter-day and intra-day RSDs were all less than 5%. The extraction recovery and method recovery were all no less than 90%. Compared with STP suspension group， the plasma concentration （except for 1 h after administration） and cerebral concentration （except for 2 h after administration） of STP in STP-SNEDDS group were all significantly increased （P<0.05）， showing significant linear relationship between them （for STP-SNEDDS）. CONCLUSIONS： Established HPLC-FLR method presents high accuracy and precision， and can be used for the distribution of STP and STP-SNEDDS in plasma and brain. The concentration of STP in plasma and brain tissue is increased after STP is made into SNEDDS.

KEYWORDS? ?Stiripentol; Self-nanoemulsifying drug delivery system; HPLC-fluorescence method; Drug distribution in vivo; Plasma; Cerebral tissue

司替戊醇（Stiripentol，STP）用于治療2周歲及以上的Dravet綜合征患者的癲癇發(fā)作[1-2]。該藥水溶性差[3]，在胃腸道中溶出緩慢且不完全，在酸性環(huán)境下穩(wěn)定性差，由于上述經(jīng)口吸收的局限性，使得該藥的日口服劑量較高[4]。自納米乳化藥物遞送系統(tǒng)（Self-nanoemulsi- fying drug delivery system， SNEDDS）由油相、表面活性劑、助表面活性劑和藥物構(gòu)成，在胃腸道中可自發(fā)形成納米尺寸的水包油型乳液，從而增加機體對難溶性藥物的吸收[5]。本課題組前期研制了STP自納米乳（STP-SNEDDS），擬通過增加STP的組織濃度和跨血腦屏障的濃度梯度差來提高其腦部生物利用度[6]，因而需開發(fā)一種特異性好、靈敏度高的體內(nèi)分析方法，以便監(jiān)測STP在血液和腦組織中的藥物濃度。已有文獻報道的STP生物樣品測定方法包括高效液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV）[2]、液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）[7]和高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FLR）[8]。其中，HPLC-UV法的檢測限約為1～2 μg/g，靈敏度較低;LC-MS法靈敏度雖較高，但對設(shè)備要求較高，且單次分析時間長（約15 min）;HPLC-FLR法靈敏度高[9]，可用于定量分析生物樣品中的STP。此外，筆者通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，STP主要通過減少患兒大腦異常興奮活動來發(fā)揮治療作用，但有關(guān)其在腦組織中分布的研究卻很少[10]，且尚無利用UPLC-FLR法測定STP腦組織藥物濃度的報道?；诖耍狙芯繑M建立生物樣品的HPLC-FLR分析方法，并對分別給予STP及其自微乳后的大鼠血漿和腦組織藥物濃度進行定量分析，以期為STP-SNEDDS的組織分布研究和進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

實驗用主要儀器包括Waters HPLC-FLR系統(tǒng)（包含1525型二元泵、2475型熒光檢測器和717 Plus型自動進樣器，美國Waters公司）、TGL-16B型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）、Bioprep-24型生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛儀器有限公司）、BSM-220.4型分析天平（上海卓精電子科技有限公司）、XH-T型渦旋混合器（金壇白塔新寶儀器廠）等。

1.2 主要藥品與試劑

實驗用主要藥品與試劑有：STP對照品（武漢豐泰威遠科技有限公司，批號20191121001，純度99.5%）、占噸酮對照品[內(nèi)標，薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司，批號GA120106，純度98%]和STP-SNEDDS[本課題組自制，規(guī)格50 mg/mL（以STP計）]等;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 動物

實驗用動物為SPF級健康SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（220±20） g，購自南通大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（蘇）20190001。所有動物均飼養(yǎng)于可控的環(huán)境條件下，環(huán)境溫度24～25 ℃，濕度50%～60%，光照/黑暗周期12 h/12 h。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱;以乙腈-25 mmol/L KH2PO4水溶液[44 ∶ 56，（V/V），pH 2.6]為流動相;流速為1.5 mL/min;激發(fā)波長為210 nm，發(fā)射波長為400 nm;柱溫為30 ℃;進樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 STP標準溶液 精密稱取STP對照品5 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得質(zhì)量濃度為500? ? ?μg/mL的STP對照品貯備液，置于4 ℃冰箱保存、待用。使用前將上述貯備液用甲醇逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.20、1.00、5.00、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL的STP系列標準溶液。

2.2.2 內(nèi)標溶液 精密稱取占噸酮對照品5 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得質(zhì)量濃度為500? ? μg/mL的內(nèi)標貯備液;再經(jīng)甲醇適當稀釋后，得質(zhì)量濃度為225 μg/mL的內(nèi)標溶液，置于4 ℃冰箱保存、待用。

2.3 大鼠血漿樣品處理

取室溫解凍后的大鼠血漿樣品100 μL，置于離心管中，加入內(nèi)標溶液（225 μg/mL）100 μL，渦旋1 min后，以10 000 r/min離心10 min，取上清液進行HPLC-FLR分析。

2.4 大鼠腦組織樣品處理

取室溫解凍后的大鼠腦組織樣品0.1 g，置于離心管中，加入生理鹽水0.3 g和乙腈0.6 g，使用生物樣品均質(zhì)儀進行均質(zhì)（22 ℃，7 m/s，每次6 s，共20個循環(huán)），然后以10 000 r/min離心10 min;取上清液100 μL，置于另一離心管中，加入內(nèi)標溶液（225 μg/mL）100 μL，渦旋1 min后，以10 000 r/min離心10 min，取上清液進行HPLC- FLR分析。

2.5 專屬性考察

取大鼠空白血漿和空白腦組織適量，分別按“2.3”“2.4”項下方法處理后再按“2.1”項下色譜條件進樣分析;取“2.2”項下STP標準溶液（40 μg/mL）和內(nèi)標溶液（225 μg/mL）分別按相同條件進樣分析;取空白血漿+內(nèi)標（225 μg/mL）+STP對照品（8 μg/mL）的混合樣品以及SD大鼠灌胃STP-SNEDDS 1 h后的血漿樣品按“2.3”項下方法處理后再按相同條件進樣分析;取空白腦組織+內(nèi)標（225 μg/mL）+STP對照品（8 μg/mL）的混合樣品以及SD大鼠灌胃STP-SNEDDS 0.5 h后的腦組織樣品按“2.4”項下方法處理后再按相同條件進樣分析，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可見，STP和內(nèi)標的峰形良好且分離完全，保留時間分別約為11、9 min;內(nèi)源性雜質(zhì)對STP檢測無干擾，提示本方法專屬性良好。

2.6 標準曲線的制備及定量下限的考察

2.6.1 血漿樣品 取大鼠空白血漿80 μL，分別加入“2.2.1”項下STP系列標準溶液20 μL，配制成STP質(zhì)量濃度分別為0.04、0.20、1.00、2.00、4.00、8.00、16.0 μg/mL的系列血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以STP質(zhì)量濃度作（X血，μg/mL）為橫坐標、STP峰面積與內(nèi)標峰面積之比（Y血）作為縱坐標進行線性回歸，得到血漿中STP的線性回歸方程為Y血=0.758 4X血+0.050 9（r=0.999 6），表明其質(zhì)量濃度的線性范圍為0.02～8.00 μg/mL;以標準曲線的最低點為血漿中STP的定量下限，即0.02 μg/mL。

2.6.2 腦組織樣品 取大鼠空白腦組織適量，按“2.4”項下方法勻質(zhì)、離心;取上清液80 μL，分別加入“2.2.1”項下STP系列標準溶液20 μL，配制成STP質(zhì)量濃度分別為0.04、0.20、1.00、2.00、4.00、8.00、16.0 μg/mL的系列腦組織勻漿樣品，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以STP質(zhì)量濃度（X腦，μg/mL）作為橫坐標、STP峰面積與內(nèi)標峰面積之比（Y腦）作為縱坐標進行回歸，得到腦組織中STP的線性回歸方程為Y腦=1.010 1X腦+0.007 5（r=0.999 4），表明其質(zhì)量濃度的線性范圍為0.02～8.00 μg/mL;以標準曲線的最低點為腦組織中STP的定量下限，即0.02 μg/mL。

2.7 精密度試驗

2.7.1 血漿樣品 取大鼠空白血漿，按“2.6.1”項下方法配制STP定量下限和低、中、高質(zhì)量濃度的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理（最終理論質(zhì)量濃度分別為0.02、0.05、2.00、6.00 μg/mL，下同），再按“2.1”項下色譜條件在同一天內(nèi)連續(xù)檢測5次，考察日內(nèi)精密度;連續(xù)測定3 d，考察日間精密度，結(jié)果見表1。

2.7.2 腦組織樣品 取大鼠空白腦組織，按“2.6.2”項下方法配制STP定量下限和低、中、高質(zhì)量濃度的腦組織樣品，按“2.4”項下方法處理（最終理論質(zhì)量濃度分別為0.02、0.05、2.00、6.00 μg/mL，下同），再按“2.1”項下色譜條件在同一天內(nèi)連續(xù)檢測5次，考察日內(nèi)精密度;連續(xù)測定3 d，考察日間精密度，結(jié)果見表2。

2.8 回收率試驗

2.8.1 血漿樣品 取大鼠空白血漿，按“2.6.1”項下方法配制STP定量下限和低、中、高質(zhì)量濃度的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。采用標準曲線法計算STP的質(zhì)量濃度，將其與相同質(zhì)量濃度的STP標準溶液直接進樣后的測定結(jié)果進行比較，計算提取回收率;將其與STP理論質(zhì)量濃度進行比較，計算方法回收率，結(jié)果見表1。

2.8.2 腦組織樣品 取空白腦組織，按“2.6.2”項下方法配制STP定量下限和低、中、高質(zhì)量濃度的腦組織勻漿樣品，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。采用標準曲線法計算STP的質(zhì)量濃度，將其與相同濃度的STP標準溶液直接進樣后的測定結(jié)果進行比較，計算提取回收率;將其與STP理論質(zhì)量濃度比較，計算方法回收率，結(jié)果見表2。

2.9 穩(wěn)定性試驗

2.9.1 血漿樣品 取大鼠空白血漿，按“2.6.1”項下方法配制STP低、中、高質(zhì)量濃度的血漿樣品，分別于室溫放置6 h、反復(fù)凍融（-80～20 ℃）3次、-80 ℃冷凍保存7 d，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。采用標準曲線法計算STP的質(zhì)量濃度，每份樣品重復(fù)檢測3次。結(jié)果，各樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好，詳見表3。

2.9.2 腦組織樣品 取空白腦組織，按“2.6.2”項下方法配制STP低、中、高質(zhì)量濃度的腦組織勻漿樣品，分別于室溫放置6 h、反復(fù)凍融（-80～20 ℃）3次、-80 ℃冷凍保存7 d，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。采用標準曲線法計算STP的質(zhì)量濃度，每份樣品重復(fù)檢測3次。結(jié)果，各樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好，詳見表4。

2.10 大鼠血漿和腦組織中STP質(zhì)量濃度的檢測

將36只SD大鼠禁食不禁水12 h后，隨機分為STP- SNEDDS組和STP混懸液組，每組18只。取STP- SNEDDS、STP對照品適量，分別用水和0.5%羧甲基纖維素鈉溶液為溶劑制得質(zhì)量濃度均為10 mg/mL（以STP質(zhì)量計）的藥液，按40 mg/kg（劑量參考本課題組前期預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置）分別單次灌胃。分別于給藥后0.5、1、2 h時（各時間點每組分別取大鼠6只）從大鼠眼眶靜脈叢取血，并收集至肝素化的離心管中，以4 000 r/min離心10 min，分離血漿，于-80 ℃保存。血漿于室溫解凍后，按“2.3”項下方法處理后進行HPLC-FLR分析，結(jié)果見表5。每次取血后，立即處死大鼠，心內(nèi)灌注生理鹽水以排出腦中的血液，再取出大腦，用生理鹽水沖洗表面后，于-80 ℃保存。腦組織于室溫解凍后，按“2.4”項下方法處理后進行HPLC-FLR分析，結(jié)果見表5。

由表5可知，在各時間點，灌胃STP-SNEDDS大鼠的血藥濃度（給藥后1 h除外）和腦組織藥物濃度（給藥后2 h除外）均顯著高于灌胃STP混懸液的大鼠（P<0.05）。這提示將STP制成SNEDDS后，其在血漿和腦組織中的濃度明顯提升。

采用Excel 2019軟件，以STP-SNEDSS為對象，以其血漿藥物濃度為橫坐標、其同時間點對應(yīng)的腦組織藥物濃度為縱坐標繪制兩者關(guān)系圖。結(jié)果，灌胃STP- SNEDDS后，隨著血藥濃度的增加，腦組織藥物濃度-血漿藥物濃度比值從0.39上升到0.55，且可見該曲線的橫軸截距為正值，呈現(xiàn)出較明顯的線性關(guān)系[11]，詳見圖2。

3 討論

3.1 分析方法的選擇

HPLC-FLR定量分析的基礎(chǔ)是光束經(jīng)過透鏡，聚集在樣品池內(nèi)的組分受光源激發(fā)后發(fā)出的熒光強度與樣品濃度成正比。由于熒光具有高靈敏度，因此該方法適用于化合物的體內(nèi)定量分析，可獲得較低的定量下限[9]。此外，由于內(nèi)標與被測組分的峰面積比值不受進樣量波動的影響，因此在定量分析時加入內(nèi)標，可在一定程度上抵消操作條件等因素的變化所引起的誤差[12]。本研究采用了與STP結(jié)構(gòu)存在一定相似性的占噸酮作為內(nèi)標，發(fā)現(xiàn)STP和占噸酮在“2.1”項下波長條件下均有較高的響應(yīng)值，且兩者色譜峰可達到基線分離，同時不受內(nèi)源性雜質(zhì)的影響，精密度、回收率、穩(wěn)定性試驗的RSD均小于5%。與已報道的HPLC-UV法[2]比較，本方法除操作簡便外，定量下限明顯降低;與已報道的LC-MS法[5]比較，本方法對設(shè)備要求簡單，且靈敏度亦較高，故可用于分析血液和腦組織中STP的分布情況。

3.2 體內(nèi)樣品處理方法的選擇

已有報道采用液-液萃取法[2]來處理生物樣品，但此法操作繁瑣且耗時長。本研究選擇常用有機溶劑甲醇和乙腈沉淀蛋白，經(jīng)離心后取上清液直接進樣分析，減少了有機溶劑的用量，也省去了氮氣流吹干、復(fù)溶等步驟，操作簡便、快速。

3.3 腦組織樣品取材的選擇

本研究的不足之一在于動物用量偏大，其主要原因是每次取血后需要處死大鼠，取出其腦組織，以分析STP在大鼠全腦中的分布情況。抽取腦脊液來間接測定腦組織中的藥物濃度，不僅可有效減少實驗動物數(shù)量，而且還可在同一動物上連續(xù)采樣，以獲得動態(tài)的腦組織藥物濃度變化趨勢[13]。本課題組曾嘗試采用這種取樣方式，但由于大鼠腦脊液量較少，且缺乏相應(yīng)的實驗條件，故未能實現(xiàn)。后續(xù)本課題組擬將STP-SNEDDS灌裝入軟膠囊后，以犬作為對象，考察灌胃給藥后STP在犬腦脊液中的分布情況。

3.4 SNEDDS提高STP口服生物利用度的可行性分析

與STP對照品相比，本課題組自制的STP-SNEDDS在大鼠血液和腦組織中具有更高的藥物濃度，且腦組織藥物濃度與血漿藥物濃度具有明顯的線性關(guān)系，提示SNEDDS具有提高STP口服生物利用度的可行性，值得進一步研究。

綜上所述，本研究所建立的HPLC-FLR法簡單、快速、準確，精密度和靈敏度較高，可用于研究STP及其自納米乳在大鼠血漿和腦組織中的分布情況，并可為后續(xù)STP-SNEDDS在其它實驗動物或人體中的藥動學(xué)研究提供方法依據(jù)。將STP制成SNEDDS后，其在血漿、腦組織中的藥物濃度均明顯提高，有利于改善生物利用度。

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（收稿日期：2020-08-10 修回日期：2020-12-15）

（編輯：張元媛）